DNA 電泳是分子生(sheng)物學實驗的“基本功”，幾乎所(suo)有(you)科研人(ren)員都繞(rao)不(bu)(bu)開(kai)。雖然(ran)操(cao)作看似簡單，但原理與細節(jie)不(bu)(bu)少，一旦(dan)忽視(shi)就可能導致條(tiao)帶模(mo)糊、結果失真(zhen)，甚(shen)至實驗“全軍覆沒”。今天我(wo)們來拆解幾個常見的誤(wu)區，從理論到實踐，幫(bang)你(ni)真(zhen)正理解電泳原理，少走彎路(lu)。

???原理回顧：DNA 為什么能“跑起來”？

DNA電泳過程(cheng)示(shi)意圖

DNA 電泳依賴的是?電場驅動：帶(dai)負電荷的(de) DNA 分子在電場中(zhong)向正極遷移(yi)。遷移(yi)速度主要受以下因(yin)素影響：

分子大小：小分(fen)子 DNA 在凝膠孔隙(xi)中阻力小，遷移更快(kuai)。

瓊脂糖濃度：濃度越高(gao)，凝膠網孔越密，分(fen)辨小分(fen)子的能(neng)力更強。

電壓與緩沖液：電(dian)壓(ya)過(guo)高會導致發(fa)熱(re)，緩沖(chong)液離子(zi)濃度不當會影響電(dian)流與分辨率(lv)。

核酸構象：線性 DNA、超(chao)螺旋質(zhi)(zhi)粒、開(kai)環質(zhi)(zhi)粒遷移速度各不相同，超(chao)螺旋質(zhi)(zhi)粒 > 線性 DNA > 開(kai)環質(zhi)(zhi)粒。

超(chao)螺旋質粒(li)（Supercoiled DNA）構(gou)象緊密，分(fen)子呈現高度壓縮狀態。在凝膠孔隙中受到(dao)的阻力最(zui)小 → 遷移速度最(zui)快。

線性(xing) DNA（Linear DNA）構象伸(shen)展，遷移速度主要(yao)取決于(yu)分子大小。一般(ban)情(qing)況下，速度介(jie)于(yu)超(chao)螺旋(xuan)和(he)開環(huan)之間。

開環(huan)質粒（Nicked/Relaxed Circular DNA）因(yin)單鏈切(qie)口導(dao)致環(huan)形松(song)弛(chi)，構象最“蓬松(song)”。在凝膠中阻力(li)最大 → 遷移速(su)度最慢。

理解這(zhe)些(xie)原理，才能真正避免實驗中(zhong)“看不懂”的(de)現象。

???常見誤區一：瓊脂糖濃度隨意配

瓊脂糖是從(cong)海藻(zao)中提(ti)取的一種線性聚合物(wu)，加熱溶解后(hou)再冷(leng)卻會形(xing)成具有網狀結構的凝膠。這個(ge)(ge)網絡(luo)就(jiu)像一個(ge)(ge)個(ge)(ge)篩(shai)孔(kong)。

瓊脂糖濃度對遷移率和分辨率的具體影響：

a. 對遷移率（Mobility）的影響

對(dui)于同一大(da)小的DNA片(pian)段(duan)，瓊(qiong)脂糖濃(nong)度越(yue)(yue)(yue)高，其受到的阻力越(yue)(yue)(yue)大(da)，遷移(yi)速度越(yue)(yue)(yue)慢。反(fan)之，濃(nong)度越(yue)(yue)(yue)低，遷移(yi)越(yue)(yue)(yue)快。

因(yin)此，在不(bu)(bu)同(tong)濃度(du)的(de)(de)凝膠上(shang)，同(tong)一個(ge)DNA片段(duan)的(de)(de)遷移位置是不(bu)(bu)同(tong)的(de)(de)，不(bu)(bu)能直接比較。

b. 對分辨率（Resolution）的影響

分辨率是(shi)指將大小相近的DNA片(pian)段分離(li)開的能(neng)力。這(zhe)是(shi)瓊脂(zhi)糖濃度最重要(yao)的影響。

• 低濃度凝膠（如0.5%-0.8%）：

篩孔大，允許大片段DNA（>10 kb）有(you)效分離。小片段DNA跑得飛快，但彼此(ci)之間難以分開，會擠在(zai)一(yi)起形成模(mo)糊的一(yi)條帶。

優點：適合分離大片(pian)段DNA。

缺點(dian)：凝膠非(fei)常脆弱柔軟(ruan)，容易破(po)損(sun)。

• 中等濃度凝膠（如0.8%-2.0%）：

這(zhe)是最常(chang)用的范(fan)圍(wei)，提供(gong)了一個(ge)良(liang)好的平衡，能有效分離(li)0.5 kb - 10 kb范(fan)圍(wei)內的DNA片段(duan)，足以(yi)滿足大多數常(chang)規實驗（如質粒(li)、PCR產(chan)物、酶切產(chan)物的鑒定(ding)）。

1%與1.7%瓊(qiong)脂糖凝膠(jiao)外觀對比

1%與1.7%瓊脂糖(tang)凝膠分辨率對比

M1: 100bp Ladder;?M2: DS2000;?M3: DS5000;?M4: 1kb Ladder

 

• 高濃度凝膠（如2%-3%）：

篩(shai)孔小(xiao)，能很(hen)好地分離小(xiao)片段(duan)DNA（<1 kb），甚至能分辨出(chu)幾十個堿基(ji)對(dui)的差異(yi)。大(da)片段(duan)DNA則幾乎無法移動，停留在(zai)加(jia)樣孔附近。

優點：對小(xiao)片段DNA分(fen)辨率極高。

缺點：凝膠脆性大，易碎。

?? 濃度(du)錯誤(wu)直接導致(zhi)分辨率下降，大片段(duan)跑不動(dong)，小(xiao)片段(duan)跑成(cheng)一團(tuan)。

 

???常見誤區二：電壓越高越好

瓊脂糖(tang)凝膠(jiao)電泳里電壓是個很關鍵的因(yin)素，直接影響到DNA/RNA 遷移速度、條帶清晰度和分離(li)效果。

1. 電壓與遷移速度

• 高電壓 → 分子遷移更快：電(dian)場力更強，帶負電(dian)的核酸(suan)分(fen)子快速向正(zheng)極移動。

• 低電壓 → 遷移較慢：分離過程更溫(wen)和，條(tiao)帶移動較慢。

2. 電壓與分辨率

• 低電壓（常用 4–6 V/cm）：遷移(yi)慢，但(dan)小片(pian)段與大片(pian)段的分離效果更(geng)好，分辨率高，適合區(qu)分相鄰大小的條帶。

• 高電壓（>10 V/cm）：條帶跑(pao)得快，但容易拉寬、拖尾，分辨率下降。

4V/cm、7V/cm、9V/cm電壓分辨率對比

M1: 100bp Ladder;?M2: DS2000

3. 電壓與熱效應

• 高電壓 → 產生焦耳熱：緩沖液升溫，凝膠(jiao)變軟甚至熔化，導致條帶彎曲（smiling bands，笑(xiao)臉效應）。

• 散熱不足：DNA 遷移(yi)速率不均勻(yun)，上(shang)下條(tiao)帶彎曲，DNA降解，影(ying)響(xiang)結果準確性。

• 解決辦法：降低電(dian)(dian)壓(ya)，或(huo)者在低溫條件(jian)下電(dian)(dian)泳（冰盒、電(dian)(dian)泳槽加冰袋(dai)）。

9V/cm電壓下(xia)不(bu)同(tong)電泳時間對比

M3: DS5000;?M4: 1kb Ladder

4. 實驗常用電壓范圍

• 常規瓊脂糖凝膠（0.7–2%）：4–10 V/cm（電壓與電泳槽兩電極間距離有關）。

• 小片段 DNA 分離（幾十到幾百 bp）：可稍高電壓（8–10 V/cm）。

• 大片段 DNA（>10 kb）：應低(di)電(dian)壓（3–5 V/cm），防止擴散和分辨率丟(diu)失。

電(dian)壓(ya)越(yue)高，電(dian)泳越(yue)快，但分辨(bian)率和凝膠完(wan)整性可(ke)能(neng)受(shou)影響；低(di)電(dian)壓(ya)遷移慢，卻能(neng)獲得更(geng)清(qing)晰、更(geng)可(ke)靠的分離效(xiao)果。

?? 推薦?5–10 V/cm，電(dian)極間(jian)距 20 cm 時，電(dian)壓保持在(zai) 100–200 V 之間(jian)。

???常見誤區三：只靠上樣染料定位

上樣(yang)緩(huan)沖液是DNA電泳(yong)中不可或缺的組成部分，它通常含有兩種主要(yao)成分：

1. 惰性染料（如溴酚藍、二甲苯青）：用于實時監控電泳進程。
2. 增稠劑（如甘油、蔗糖、Ficoll）：增加樣品密度，確保樣品沉入加樣孔底部。

染料在電泳(yong)中起到了“視覺參考線”或“前(qian)鋒”的作用(yong)，其定(ding)位功能主要(yao)體現在：

1. 指示電泳進程，統一上樣基準。
2. 預估DNA片段的遷移位置：
   • 不同的染料在不同濃度的瓊脂糖凝膠中，其遷移行為與特定大小的DNA片段相似。因此，它們可以用來粗略估計未知DNA條帶的大小。
   • 溴酚藍（Blue：在0.8%-1.0%的瓊脂糖凝膠中，其遷移速度大約與300-500 bp的DNA片段相當。
   • 二甲苯青（Blue：在0.8%-1.0%的瓊脂糖凝膠中，其遷移速度大約與4000-5000 bp的DNA片段相當。
   • 例如：?如果你看到溴酚藍條帶快跑出凝膠了，你就知道所有小于500 bp的DNA片段可能已經接近凝膠底部，即將跑出。

???不能憑染料位置判斷片段大小，這也是為什么 DNA Marker 在電(dian)泳中(zhong)不可或缺。

???常見誤區四：Marker 隨便用

在分子生物學實驗(yan)中(zhong)，DNA Marker常被簡單視(shi)為泳道中(zhong)的(de)“對照”或“標(biao)尺”，但它的(de)作用遠不(bu)止于此。Marker的選擇直接決定了實驗數據的可解釋性、準確性和美觀度，是實驗設計中最容易被忽視卻至關重要的一環。一個不合適的Marker可能導致整個實驗結果失去價值。

低質量或不匹配Marker帶來的三大問題：

1. 片段分布稀疏：導致大小判斷“失準”
   • 問題：?當Marker的條帶間隔過大，或恰好在你目標片段的關鍵區域缺少條帶時，你無法進行精確的插值估算。例如，如果你的PCR產物在750 bp左右，而Marker僅在500 bp和1000 bp有條帶，你只能模糊地估計產物大小在“500到1000 bp之間”，無法得出準確結論。
   • 后果：?實驗數據的精確度大打折扣，無法滿足克隆鑒定、酶切驗證等對大小要求嚴格的實驗需求。
2. 條帶模糊拖尾：影響結果呈現與可信度
   • 問題：?由于保存不當、反復凍融或生產工藝問題，Marker條帶可能出現擴散、模糊或強度不均（有的亮有的暗）。這不僅影響觀察，更嚴重影響成像質量。
   • 后果：?在論文、報告或展示中，模糊的Marker會讓整個實驗結果顯得不專業、不可靠，降低數據的可信度。審稿人或同行可能會因此質疑你的實驗嚴謹性。
3. 缺少關鍵指示條帶：降低實驗效率
   • 問題：?許多高效能的Marker會在500 bp、1000 bp、1500 bp和2000 bp等關鍵位置設置特別亮、特別粗的“指示條帶”或“參考條帶”。
   • 后果：?缺少這些指示條帶，你在快速瀏覽凝膠時就無法瞬間定位。你需要花費額外的時間去數條帶、比對大小，大大降低了實驗分析的效率。尤其在處理多個樣品時，這種效率損失尤為明顯。

如何選擇一個“合理”的Marker？

一(yi)個優秀的(de)Marker不(bu)應只是DNA片段的(de)簡單集合，而(er)應是一(yi)個精心設計的(de)測(ce)量(liang)工具。以下是選(xuan)擇標準：

???1. 覆蓋合適的片段范圍
這是最基本的要求。選擇的Marker其條帶范圍必須將你的目標DNA片段“包圍”在中間，而不是(shi)落在兩(liang)端(duan)。例如：

• 常規PCR產物鑒定（100 bp - 2 kb）：?選擇范圍覆蓋100 bp至2000 bp的Ladder，如著名的100 bp Plus Ladder或1 kb Plus Ladder。
• 大片段酶切或基因組DNA分析（>5 kb）：?應選擇λ DNA HindIII digest等大片段Marker。
• 小片段 miRNA/siRNA 分析（<100 bp）：?需要專門的低分子量Marker。

???2. 條帶清晰、濃度均一

• 清晰銳利：?每條帶都應邊界清晰，無拖尾或擴散現象，這表明生產工藝好且保存得當。
• 亮度均一：?理想狀態下，所有條帶應具有相近的亮度（即DNA含量一致），這確保了不同大小的條帶都能被清晰成像，不會出現小條帶看不見、大條帶又過曝的情況。

???3. 含有突出的指示條帶，便于快速定位

• 這是區分“優秀”Marker和“普通”Marker的關鍵。許多高端Marker會特意將500 bp和1000 bp（有時還包括1500 bp和2000 bp）的條帶做得更濃、更亮。
• 好處：?在紫外燈下，你的眼睛能立刻抓住這幾個“地標”，瞬間建立起凝膠的空間距離與分子大小的對應關系，無需仔細數格子，極大提升了判讀效率。

???常見誤區五：忽略緩沖液與染料差異

在瓊(qiong)(qiong)脂糖凝膠電泳中(zhong)，新(xin)手往(wang)往(wang)將全部注意力集(ji)中(zhong)在瓊(qiong)(qiong)脂糖濃度和(he)電壓設置上，而(er)忽(hu)略了兩個同樣至關(guan)重要(yao)的因素：電泳緩沖體系和核酸染料。它們并非(fei)“通用”的試劑，其選(xuan)擇直接影(ying)響(xiang)DNA的遷移率、條(tiao)帶分辨(bian)率和實驗安全性，錯誤的選(xuan)擇會(hui)悄然破壞你的實驗結果(guo)。

一、電泳緩沖液：不僅僅是導電的溶液

最常用(yong)的(de)緩沖液是TAE和(he)(he)TBE，它們化(hua)學成(cheng)分不(bu)同，決定了(le)其特性和(he)(he)適用(yong)場景(jing)截然不(bu)同。

?? 如何選擇？

• 首選TAE的情況：?進行大片段DNA分離（如基因組DNA酶切）、DNA膠回收（兼容性更好）或需要快速電泳時。
• 首選TBE的情況：?進行小片段DNA分離（如PCR產物、SSR分析）、高分辨率電泳（如區分相差幾十bp的條帶）或需要長時間電泳時。

?? 重要提示：絕對不可將TAE和TBE緩沖液或其濃縮母液混用！?這(zhe)會導致pH和離(li)子強度(du)異常(chang)，產生不可預(yu)測的(de)遷移結果。

二、核酸染料：安全與效能的權衡

染料的(de)(de)選擇(ze)關乎(hu)實驗(yan)結(jie)果(guo)的(de)(de)清晰度(du)和(he)操(cao)作者的(de)(de)生命安(an)全。

?? 如何選擇？

• 追求成本與靈敏度：?可能仍在用EB染料，但必須配備嚴格的防護和廢物處理流程。

• 追求安全與便捷（現代實驗室首選）：AIE-Gelgreen或GelRed是更安全的選擇，尤其適合教學實驗室或沒有專門EB處理設施的實驗室。它們通常與藍光成像系統配套，能最大程度減少對DNA的損傷（UV會使DNA產生嘧啶二聚體，影響下游實驗）。
• 注意：?如果實驗下游需要進行膠回收克隆，建議選擇對酶活影響更小的染料。

總結與實驗設計指南

忽略緩沖液和染料的選擇，就像用(yong)錯(cuo)誤(wu)的尺子和昏(hun)暗的燈光去測量一個精(jing)細(xi)的零件。

?? 在設計實驗時，請遵循這個流程進行選擇：

• 看片段大小：
  • 大片段(>5 kb)?→ 優先選TAE緩沖液。
  • 小片段(<1 kb)?→ 優先選TBE緩沖液，以獲得更高分辨率。
• 看實驗目的：
  • 常規鑒定?→ 可選擇性價比高的方案（如DSView染料、EB染料）。
  • 膠回收?→ 優先選TAE?+?對酶活無抑制的染料（如AIE-Gelgreen）。
  • 發表級高清圖片?→ 優先選高分辨率緩沖液(TBE)?+?高靈敏度/低背景的染料（如AIE-Gelgreen）。

AIE-Gelgreen核酸凝膠染料

• 看安全性與成本：
  • 安全絕對優先?→ 毫不猶豫地選擇AIE-Gelgreen等安全染料和藍光成像系統，即使成本稍高。
  • 權衡遷移準確性 → 如果擔心某些染料影響遷移，可在Marker和樣品中使用完全相同的上樣緩沖液和染料負載，以消除誤差。

因此，將緩沖液和染料視為與凝膠濃度、電壓同等重要的核心實驗參數，根據你的(de)具(ju)體(ti)需求進行(xing)理性選擇，是獲(huo)得可靠、美觀、安全實(shi)驗結(jie)果的(de)必備步驟(zou)。

 

??小結

DNA 電泳看似“基礎”，卻暗藏不少原理性細節。掌握濃度(du)、電壓、緩沖液、Marker 與染料(liao)的選(xuan)擇規律，才能保證結果：

• 條帶清晰

• 分辨率高

• 實驗可重復、可展示

 

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