要先對(dui)PCR目的(de)序列的(de)長度有個(ge)大致估(gu)計(ji)：

第一步：找到Primer3的站(zhan)點。你不用記(ji)(ji)住這個站(zhan)點，但是要記(ji)(ji)住“Primer3”這個詞，然(ran)后打開(kai)GOOGLE首頁，輸入(ru)Primer3，跳出來的第一個項(xiang)目就是了(le)“”

網址是。

第二步：貼(tie)上模板序列(lie)。進入Primer3站(zhan)點，可以看到(dao)一個(ge)引物設計的(de)(de)界面(mian)。在“Paste?source sequence?below (5'->3'…..”下(xia)面(mian)的(de)(de)大空框里面(mian)把(ba)你的(de)(de)模板序列(lie)粘帖進去。注意是5'->3'方向的(de)(de)，數字或(huo)者空格都沒(mei)關系，軟件(jian)會自動(dong)過濾(lv)的(de)(de)。

第三步：重要參數設定。首先是“Product Size Ranges”，如果你不希望軟件給你隨便做的話，首先要調整的就是這個參數。默認的參數實際上是從100到1000，這個你得自己改，如果你希望產物的大小符合你的預期，盡可能把范圍改小，比如480-500，具體看情況調整。第二個參數是“Primer Size”，默認值一般可以用，但是，當你用熟了這個軟件，你自己就知道該怎么改了。第三個參數是”Primer Tm”這個和Primer Size差不多。

第四(si)步：Pick primers：?點一下這個按鈕，符(fu)合你(ni)大(da)小預期的(de)primer就出(chu)來了(le)，看看Primer3 Output的(de)界面，多么漂亮！你(ni)要(yao)的(de)primer出(chu)來了(le)，而(er)且有primer在序列上的(de)位(wei)置(zhi)比對圖，還(huan)要(yao)primer本(ben)身的(de)信息，包括位(wei)置(zhi)，長(chang)度(du)，Tm，GC含量，任何(he)位(wei)置(zhi)互(hu)補(bu)堿基(ji)數，3'端互(hu)補(bu)堿基(ji)數，以及引(yin)(yin)物序列，（注(zhu)意，下游(you)引(yin)(yin)物是5'->3'），還(huan)要(yao)產物大(da)小，兩引(yin)(yin)物間任意互(hu)補(bu)堿基(ji)數，兩引(yin)(yin)物間3'端互(hu)補(bu)堿基(ji)數等。如(ru)果引(yin)(yin)物尚在參(can)數設定的(de)范圍內，但(dan)還(huan)不是最佳，將會(hui)給出(chu)警告。

第五步：引(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)物(wu)設(she)(she)計(ji)檢驗：可(ke)以(yi)(yi)僅(jin)僅(jin)設(she)(she)計(ji)一(yi)向(xiang)引(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)物(wu)，只(zhi)要(yao)在(zai)Pick?left?primer或者Pick?right?primer前面(mian)的(de)(de)勾(gou)勾(gou)掉一(yi)個就可(ke)以(yi)(yi)。也可(ke)以(yi)(yi)自(zi)己定義(yi)引(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)物(wu)，放在(zai)Primer框里，（注意，下游(you)引(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)物(wu)的(de)(de)書寫(xie)反(fan)向(xiang)仍然是5'->3'）如(ru)果符合設(she)(she)定的(de)(de)條(tiao)件(jian)，軟件(jian)將對給出(chu)引(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)物(wu)評分(fen)，同(tong)時給出(chu)警(jing)告信(xin)息，根據(ju)警(jing)告信(xin)息可(ke)以(yi)(yi)適當對自(zi)定義(yi)引(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)物(wu)做些調整即可(ke)，警(jing)告信(xin)息也讓你做實(shi)驗的(de)(de)時候心(xin)中有數。對于(yu)文獻發表的(de)(de)引(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)物(wu)，最好(hao)都(dou)要(yao)檢查一(yi)下，這樣(yang)就可(ke)以(yi)(yi)避(bi)免(mian)(mian)被別(bie)(bie)人有意無意誤導。至于(yu)RT-PCR所用的(de)(de)引(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)物(wu)，最好(hao)是使(shi)得產(chan)物(wu)跨過內含子(zi)，這樣(yang)避(bi)免(mian)(mian)潛(qian)在(zai)DNA對RT-PCR的(de)(de)干擾。實(shi)際做引(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)物(wu)的(de)(de)時候，要(yao)把內含子(zi)都(dou)去掉，僅(jin)僅(jin)把外顯(xian)子(zi)序(xu)列放入源序(xu)列框中，并且通(tong)過自(zi)定義(yi)引(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)物(wu)設(she)(she)計(ji)的(de)(de)方法，使(shi)上(shang)下游(you)引(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)物(wu)分(fen)別(bie)(bie)全部或者部分(fen)落在(zai)不同(tong)外顯(xian)子(zi)上(shang)。至于(yu)如(ru)何快速識別(bie)(bie)內含子(zi)和外顯(xian)子(zi)以(yi)(yi)及電(dian)子(zi)PCR，我將抽空(kong)另做說明。

至于(yu)設計(ji)出來(lai)的(de)引物(wu)的(de)實(shi)際效果，根據(ju)我的(de)經驗，一(yi)(yi)般情(qing)況下都能做到PCR一(yi)(yi)次成功，也(ye)許隨便(bian)那一(yi)(yi)段(duan)序(xu)列做引物(wu)也(ye)能達到很好的(de)效果，但是不管怎么說，軟件(jian)做引物(wu)可以(yi)讓自己心(xin)中(zhong)有(you)數。最后，GOOD LUCK TO EVERYONE.