1 請問(wen)配制聚丙(bing)烯酰胺凝膠電(dian)泳膠時，促凝的是(shi)TEMED還是(shi)過硫(liu)酸銨(an)？膠聚時間很長(chang)如何解決？
過硫酸銨提供驅動丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合所需的自由基，而TEMED通過催化過硫酸銨形成自由基而加速它倆的聚合。膠聚合時間長可能是TEMED失效了，過硫酸銨固體時間過久也會失效的。
一個讓PAGE膠很快聚合的方法：
不(bu)要(yao)先配(pei)AP（過(guo)硫(liu)酸銨）溶液，因為(wei)AP很容易(yi)變質。在(zai)保證TEMED和(he)(he)AP質量(liang)的(de)(de)(de)情(qing)況(kuang)下，每次配(pei)膠時，直(zhi)接稱一定量(liang)的(de)(de)(de)AP粉(fen)劑溶入液體狀(zhuang)態(tai)的(de)(de)(de)PAGE中，這(zhe)樣可(ke)以保證AP的(de)(de)(de)催化能力，而(er)且可(ke)以多加一點。配(pei)25ml的(de)(de)(de)PAGE膠，加0.03克AP粉(fen)劑，最(zui)后加入25ulTEMED，20分鐘左右(you)就可(ke)以凝(ning)固(gu)（當然(ran)這(zhe)個時候拔梳子，會有少量(liang)未凝(ning)固(gu)的(de)(de)(de)PAGE在(zai)孔里形成(cheng)絲狀(zhuang)干擾，使加的(de)(de)(de)樣品(pin)看起來不(bu)太(tai)漂亮，但一般不(bu)影(ying)響跑膠效果和(he)(he)條帶的(de)(de)(de)形狀(zhuang)和(he)(he)位置）。
2 DNA電泳的MARKER怎么是扭曲的？
1、 配制膠時的緩沖液需要和電泳緩沖液不是同時配制的.最好是同時配制.電泳時緩沖液高過液面1－2mm即可。
2、 電泳時電壓過高,可以在電泳前15分鐘用較低電壓(3V/cm),等條帶出孔后比較漂亮了.然后再調電壓。
3、 上(shang)樣時盡量(liang)慢(man)慢(man)加樣,等樣品自然(ran)沉降后再加電壓(ya)。
3 跑出的DNA帶模糊？
1、 DNA降解：避免核酸酶污染。
2、 電泳緩沖液陳舊:電泳緩沖液多次使用后，離子強度降低，pH值上升，緩沖能力減弱，從而影響電泳效果。建議經常更換電泳緩沖液。
3、 所用電泳條件不合適:電泳時電壓不應超過20V/cm，溫度＜30℃；巨大DNA鏈電泳，溫度應＜15℃；核查所用電泳緩沖液是否有足夠的緩沖能力。
4、 DNA上樣量過多：減少凝膠中DNA上樣量。
5、 DNA樣含鹽過高：電泳前通過乙醇沉淀去除過多的鹽。
6、 有蛋白污染：電泳前酚抽提去除蛋白。
7、 DNA變性(xing)：電泳前(qian)勿加熱，用20mM NaCl緩沖(chong)液稀釋(shi)DNA。
4 有不規則DNA帶遷移?
1、 對于λ/Hind III片段cos位點復性：電泳前于65℃加熱DNA 5分鐘，然后在冰上冷卻5分鐘。
2、 電泳條件不合適：電泳電壓不超過20V/cm；溫度＜30℃；經常更換電泳緩沖液。
3、 DNA變性：以20mM NaCl Buffer稀釋DNA，電泳前勿加熱(re)。
5 跑出的DNA條帶帶弱或無DNA帶？
1、 DNA的上樣量不夠：增加DNA的上樣量；聚丙烯酰胺凝膠電泳比瓊脂糖電泳靈敏度稍高，上樣量可適當降低。
2、 DNA降解：避免DNA的核酸酶污染。
3、 DNA走出凝膠：縮短電泳時間，降低電壓，增強凝膠濃度。
4、 對(dui)于EB染(ran)色(se)的(de)DNA，所(suo)用光(guang)源(yuan)不合(he)適(shi)??應用短波長（254nm）的(de)紫(zi)外光(guang)源(yuan)。
6 跑出的DNA帶缺失不完整是怎么回事?
1、 如果是小DNA帶走出凝膠，可以縮短電泳時間或降低電壓或增強凝膠濃度。
2、 分子大小相近的DNA帶不易分辨??增加電泳時間，核準正確的凝膠濃度。
3、 DNA 變性：電泳前請勿高溫加熱DNA鏈，以20mM NaCl Buffer稀釋DNA。
DNA鏈巨大(da)，常規凝膠(jiao)(jiao)電(dian)泳不(bu)合(he)適??在脈沖凝膠(jiao)(jiao)電(dian)泳上(shang)分析。
7 做(zuo)PCR電泳后(hou)跑(pao)電泳，目的(de)基因是(shi)489BP的(de)，結果(guo)每次(ci)切膠(jiao)回(hui)收后(hou)再跑(pao)電泳就變成500多(duo)了(le)，快到600了(le)？為什(shen)么(me)？
有(you)時(shi)只靠電泳(yong)結(jie)果(guo)(guo)判斷是不準確(que)的(de)，同樣(yang)(yang)(yang)的(de)片(pian)段(duan)(duan)每次(ci)跑的(de)遠近會有(you)不同。有(you)經驗顯(xian)示目的(de)片(pian)段(duan)(duan)是1300多，結(jie)果(guo)(guo)就跑到1000的(de)marker下(xia)(xia)面去了(le)，后來證(zheng)實片(pian)段(duan)(duan)沒有(you)問(wen)題。也(ye)有(you)做的(de)一(yi)個片(pian)段(duan)(duan)也(ye)是這(zhe)樣(yang)(yang)(yang)，是490BP.理論上兩個條帶一(yi)樣(yang)(yang)(yang)，可是PCR結(jie)果(guo)(guo)顯(xian)示就是大小不一(yi)致。然后回收以后的(de)檢(jian)測(ce)(ce)結(jie)果(guo)(guo)又全部都(dou)一(yi)樣(yang)(yang)(yang)了(le)，后來又拿去做了(le)下(xia)(xia)一(yi)個測(ce)(ce)序，才知(zhi)道根本(ben)沒有(you)問(wen)題。
8 跑完PCR，暫時不方(fang)便膠回收，條帶已經切下來放(fang)到(dao)ep管里了，這個能保存么？會不會有不良影響？
還有個問題，pcr的產物可以不可以直接拿來做模板再進行pcr。我試過，可是總是出現一個拖尾亮條，沒有帶，是什么原因呢？
割(ge)下來(lai)的膠放(fang)在(zai)-20保存兩(liang)個星期完全(quan)沒(mei)(mei)有問題(ti)。切下來(lai)的膠放(fang)在(zai)4度冰箱(xiang)中4、5小時沒(mei)(mei)有問題(ti)回(hui)收的效果也很好。
9 凝膠回收DNA實驗的關鍵在哪里?
最關(guan)鍵的是切膠(jiao)(jiao)之(zhi)后(hou),溶(rong)膠(jiao)(jiao)的那一(yi)步(bu)(bu)(bu).切膠(jiao)(jiao)的時(shi)候要(yao)盡量(liang)把多(duo)余的瓊脂(zhi)糖凝(ning)(ning)膠(jiao)(jiao)切干(gan)凈,按照實(shi)驗步(bu)(bu)(bu)驟,第一(yi)步(bu)(bu)(bu)應該是將膠(jiao)(jiao)充分(fen)(fen)的溶(rong)化(hua).這(zhe)以(yi)后(hou)步(bu)(bu)(bu)一(yi)定要(yao)做充分(fen)(fen),保(bao)證凝(ning)(ning)膠(jiao)(jiao)已經完全溶(rong)解(jie)了.加乙醇這(zhe)步(bu)(bu)(bu)也很關(guan)鍵，當(dang)凝(ning)(ning)膠(jiao)(jiao)溶(rong)解(jie)后(hou)最好(hao)多(duo)過幾次柱子。還有(you)就是洗(xi)(xi)(xi)脫的那一(yi)步(bu)(bu)(bu)。洗(xi)(xi)(xi)脫的時(shi)候最好(hao)用(yong)加熱到(dao)60度 的洗(xi)(xi)(xi)脫液洗(xi)(xi)(xi)脫，如(ru)果實(shi)在效(xiao)果不好(hao)可以(yi)分(fen)(fen)兩次洗(xi)(xi)(xi)脫。
10 切膠的時候如何能切的準呢？條帶的位置肉眼很難判斷出來，如何判斷條帶的位置呢？
可以將產(chan)物(wu)與Marker一起(qi)電泳，染色后，在(zai)(zai)紫(zi)外(wai)燈下觀(guan)察結果，跟Marker進行相比，就知(zhi)道要(yao)的是哪條帶(dai)。注意，紫(zi)外(wai)燈下切(qie)膠(jiao)速度要(yao)快，否則(ze)DNA會降(jiang)解，另外(wai)，紫(zi)外(wai)線對身體(ti)傷害很(hen)大，特別是眼睛，請注意采取保護措(cuo)施（比如(ru)在(zai)(zai)專門的箱子里切(qie)，帶(dai)眼鏡等）。RNA 用(yong)具要(yao)用(yong)10%的NaOH浸泡過(guo)液，再用(yong)DEPC水沖(chong)洗干(gan)凈 70%的乙醇(chun)用(yong)過(guo) 國產(chan)分析乙醇(chun)有雜質，RNA酶還會有，并帶(dai)入其(qi)它(ta)污染。