1 克隆PCR產物的最優條件是什么？
最(zui)佳插入(ru)片段：載(zai)體比需(xu)實(shi)驗確定。1：1（插入(ru)片段：載(zai)體）常為最(zui)佳比，摩(mo)爾數(shu)比1：8或(huo)8：1也行。應測定比值范圍(wei)。連(lian)(lian)接用5ul 2X連(lian)(lian)接液, 50ng質粒DNA,1Weiss單位的T4連(lian)(lian)接酶(mei)，插入(ru)片段共10ul。室溫(wen)保溫(wen)1小時，或(huo)4℃過夜。在這2種(zhong)溫(wen)度下，缺T-凸出端的載(zai)體會自連(lian)(lian)，產生(sheng)藍斑。室溫(wen)保溫(wen)1小時能(neng)滿足大多數(shu)克隆要求，為提(ti)高(gao)連(lian)(lian)接效率，需(xu)4℃過夜。

2 PCR產物是否需要用凝膠純化？
如(ru)凝(ning)膠(jiao)分(fen)析擴增產物只有一條(tiao)帶，不(bu)需要用凝(ning)膠(jiao)純化(hua)。如(ru)可見其(qi)他雜帶，可能是(shi)積累了大量引(yin)物的(de)二聚(ju)體(ti)。少量的(de)引(yin)物二聚(ju)體(ti)的(de)摩爾數(shu)也很高，這會產生(sheng)高比例的(de)帶有引(yin)物二聚(ju)體(ti)的(de)克隆，而非目的(de)插入片(pian)段。為此需在克隆前做(zuo)凝(ning)膠(jiao)純化(hua)。

3 如果沒有回收到目的片段，還需要作什么對照實驗？
A）涂布未轉化的感受態細胞。
如有菌落，表明氨芐失效，或污染上帶有氨芐抗型的質粒，或產生氨芐抗型的菌落。
B）轉化完整質粒，計算菌落生長數，測定轉化效率。
例如，將1ug/ul質粒1:100稀釋,1ul用于100ul感受態細胞轉化。用SOC稀釋到1000ul后，用100ul鋪板。培養過夜，產生1000個菌落。轉化率為： 產生菌落的總數/鋪板DNA的總量。
鋪板DNA的總量是轉化反應所用的量除以稀釋倍數。具體而言轉化用10ng DNA，用SOC稀釋到1000u后含10 ngDNA，用1/10鋪板，共用1 ng DNA。轉化率為：
1000克隆X10（3次方） ng /鋪板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug
轉化pGEM-T應用10（8次方）cfu/ ug感受態細胞
如沒有菌落或少有菌落，感受態細胞的轉化率太低。
C）如用pGEM-T正對照，或PCR產物，產生>20-40藍斑（用指定步驟10（8次方）cfu/ ug感受態細胞），表明載體失去T。可能是連接酶污染了核酸酶。T4 DNA連接酶（M1801，M1804，M1794）質量標準好無核酸酶污染，不應用其它來源的T4 DNA連接酶替換。
D）用pGEM-T或pGEM-T Easy載體(ti)，連接pGEM-T正(zheng)對(dui)照(zhao)，轉化高頻率感受態細胞（10（8次方）cfu/ug）,按(an)照(zhao)指定(ding)的實驗步(bu)驟，可得100個(ge)菌落(luo)，其中60%應為白斑，如產生>20-40藍(lan)斑, 沒有菌落(luo)或少有菌落(luo)，連接有問題(ti)。

4 對照實驗結果好，卻沒有回收到目的片段，實驗出了什么問題？
A）連接用室溫保溫1小時，能滿足大多數克隆，為提高效率，需4℃過夜。
B）插入片段帶有污染，使3`-T缺失，或抑制連接，抑制轉化。為此，將插入片段和pGEM-T正對照混合，再連接。如降低了對照的菌落數，插入片段需純化，或重新制備。如產生大量的藍斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy載體3`-T缺失。
C）插入片段不適于連接。用凝膠純化的插入片段，因受UV過度照射，時有發生。UV過度照射會產生嘧啶二聚體，不利于連接，DNA必需重新純化。
D）帶有修復功能的耐熱DNA聚合酶的擴增產物末端無A，后者是pGEM-T或pGEM-T Easy載體克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。詳情查pGEM-T pGEM-T Easy載體技術資料（TM042）。
E）高度重(zhong)復序列可(ke)能會不(bu)穩定，在擴增中產(chan)生缺失(shi)和重(zhong)排，如(ru)發現插入片(pian)段高頻率(lv)地產(chan)生缺失(shi)和重(zhong)排，需用(yong)重(zhong)組缺陷大腸桿(gan)菌(jun)菌(jun)株，如(ru)SURE細胞