1、從柱離(li)心式產(chan)品的流行看(kan)經典方法的缺點(dian) （或者操(cao)作重點(dian)）

柱式(shi)方(fang)法的(de)(de)風行是(shi)無法否(fou)定的(de)(de)現實。下面通過柱式(shi)方(fang)法與經典(dian)(dian)方(fang)法的(de)(de)比較，看一(yi)看如何注(zhu)意經典(dian)(dian)方(fang)法的(de)(de)操(cao)作重點。

裂(lie)解(jie)，二者幾乎沒(mei)有任何區別(bie)。去蛋白質(zhi)，柱(zhu)(zhu)式(shi)靠的(de)是(shi)柱(zhu)(zhu)材料對蛋白質(zhi)吸附力低(di)這(zhe)一(yi)特點，將蛋白質(zhi)殘留(liu)(liu)控制(zhi)在(zai)(zai)比較低(di)的(de)水(shui)平 (并不(bu)(bu)是(shi)/也(ye)不(bu)(bu)能徹底去除(chu))；經典(dian)方(fang)法(fa)最(zui)常用(yong)的(de)是(shi) PC 抽提(ti)，可以將蛋白質(zhi)去除(chu)得(de)更徹底一(yi)些。其它(ta)大分子(zi)(zi)雜質(zhi) - 如(ru)多糖等 - 的(de)去除(chu)，柱(zhu)(zhu)式(shi)的(de)與蛋白質(zhi)的(de)去除(chu)相似，但(dan)經典(dian)方(fang)法(fa)中(zhong)卻沒(mei)有如(ru)此方(fang)便的(de)對應方(fang)法(fa)。小分子(zi)(zi)物 (鹽等) 的(de)去除(chu)，是(shi)柱(zhu)(zhu)式(shi)方(fang)法(fa)最(zui)優勢所(suo)在(zai)(zai)。如(ru)果柱(zhu)(zhu)子(zi)(zi)設計沒(mei)有問題，離(li)心后柱(zhu)(zhu)子(zi)(zi)中(zhong)殘留(liu)(liu)的(de)液體(ti)穩(wen)定(ding)(ding)而少；柱(zhu)(zhu)式(shi)的(de)洗(xi)滌具有“流水(shui)洗(xi)滌”的(de)效果；柱(zhu)(zhu)式(shi)中(zhong)的(de)核(he)酸是(shi)不(bu)(bu)成團塊的(de) - 這(zhe)三個(ge)特點決定(ding)(ding)了柱(zhu)(zhu)式(shi)的(de)洗(xi)滌效率比經典(dian)的(de)洗(xi)滌效率高，所(suo)以，柱(zhu)(zhu)式(shi)純化的(de)核(he)酸純度比較高。

2、 應該使用(yong)多少菌(jun)液(ye)？

根據我們的(de)經(jing)驗，如為高拷(kao)貝(bei)質(zhi)粒(li)(li)(li)（如：pUC118等），使(shi)用(yong)2 ml培養液(ye)(ye)(ye)與(yu)4 ml培養液(ye)(ye)(ye)純(chun)(chun)化的(de)質(zhi)粒(li)(li)(li)DNA的(de)收量差別(bie)不是(shi)很大，可以(yi)純(chun)(chun)化到20-25 μg的(de)高純(chun)(chun)度質(zhi)粒(li)(li)(li)DNA。如提取(qu)地拷(kao)貝(bei)質(zhi)粒(li)(li)(li)或大于(yu)10 kb質(zhi)粒(li)(li)(li)，建議使(shi)用(yong)5-10 ml的(de)菌(jun)液(ye)(ye)(ye)（可分幾(ji)管收集菌(jun)體(ti)，按比例(li)加入溶液(ye)(ye)(ye)Ⅰ、溶液(ye)(ye)(ye)Ⅱ、溶液(ye)(ye)(ye)Ⅲ，再將離心上清(qing)分批轉移至DNA純(chun)(chun)化柱(zhu)），吸(xi)(xi)附(fu)和洗脫的(de)時(shi)(shi)間可以(yi)適當延長，洗脫時(shi)(shi)使(shi)用(yong)的(de)溶液(ye)(ye)(ye)Eluent應在(zai)60℃水浴預熱。高純(chun)(chun)度質(zhi)粒(li)(li)(li)小提試劑(ji)盒所配(pei)硅膠柱(zhu)的(de)最(zui)大吸(xi)(xi)附(fu)量是(shi)40 μg，滿(man)足(zu)絕大多數實(shi)驗所需(xu)用(yong)量。

3、溶(rong)液Ⅰ、溶(rong)液Ⅱ、溶(rong)液Ⅲ的用量問題

溶(rong)液Ⅰ、溶(rong)液Ⅱ、溶(rong)液Ⅲ的(de)(de)比例是(shi)固定的(de)(de)，如果增加或(huo)減少(shao)用(yong)量(liang)都請按比例變化，但是(shi)一般來說，用(yong)量(liang)原(yuan)則是(shi)確保能(neng)徹(che)底(di)(di)裂解樣品(pin)，同時使裂解體系中核酸的(de)(de)濃(nong)度(du)(du)適中（具體表現是(shi)加入溶(rong)液Ⅱ后，能(neng)形成澄清的(de)(de)裂解溶(rong)液）。濃(nong)度(du)(du)過低(di)，將導致沉(chen)淀效(xiao)率低(di)，影響得(de)率；濃(nong)度(du)(du)過高，去除雜質的(de)(de)過程復(fu)雜且不徹(che)底(di)(di)，導致純度(du)(du)下降。溶(rong)液的(de)(de)用(yong)量(liang)是(shi)以樣品(pin)中蛋白質的(de)(de)含(han)量(liang)為(wei)(wei)基(ji)準的(de)(de)，而不是(shi)以核酸含(han)量(liang)為(wei)(wei)基(ji)準。

4、 溶液(ye)Ⅱ操作時要注意的事項

在反應(ying)液(ye)充分(fen)的時候(hou)，第一(yi)，反應(ying)的時間(jian)不能過(guo)長，長時間(jian)的堿(jian)性(xing)條件會打斷DNA，基(ji)因組(zu)DNA一(yi)旦(dan)發生斷裂(lie)，只要是(shi)50－100 kb大小的片斷，就沒有(you)辦(ban)法(fa)再被(bei)溶液(ye)Ⅲ沉(chen)淀了；第二，不得激烈(lie)振蕩，不然基(ji)因組(zu)DNA也會斷裂(lie)最后得到的質粒上總會有(you)大量的基(ji)因組(zu)DNA混入，瓊脂糖電(dian)泳可以(yi)觀察到一(yi)條濃濃的總DNA條帶。

5、質粒質量檢測

將(jiang)抽提好(hao)(hao)的(de)(de)(de)(de)核(he)(he)酸(suan)直接用(yong)(yong)(yong)于后(hou)(hou)續的(de)(de)(de)(de)實(shi)(shi)驗(yan)(yan)，是(shi)(shi)唯一可靠的(de)(de)(de)(de)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)方(fang)(fang)(fang)法；除此之外(wai)的(de)(de)(de)(de)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)方(fang)(fang)(fang)法，都(dou)是(shi)(shi)相對的(de)(de)(de)(de)，而(er)且并不(bu)(bu)十分(fen)(fen)可信(xin)。目前(qian)用(yong)(yong)(yong)于正式實(shi)(shi)驗(yan)(yan)前(qian)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)核(he)(he)酸(suan)質(zhi)量(liang)的(de)(de)(de)(de)方(fang)(fang)(fang)法，一是(shi)(shi)電(dian)(dian)泳(yong)，二(er)是(shi)(shi)紫外(wai)分(fen)(fen)光光度儀。電(dian)(dian)泳(yong)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)的(de)(de)(de)(de)主要是(shi)(shi)核(he)(he)酸(suan)的(de)(de)(de)(de)完整性和(he)大(da)小，只要核(he)(he)酸(suan)不(bu)(bu)是(shi)(shi)太小或者(zhe)太大(da) (超(chao)出電(dian)(dian)泳(yong)分(fen)(fen)離范圍)，該方(fang)(fang)(fang)法還是(shi)(shi)非常(chang)(chang)可信(xin)的(de)(de)(de)(de)；電(dian)(dian)泳(yong)還可以(yi)用(yong)(yong)(yong)于估計核(he)(he)酸(suan)的(de)(de)(de)(de)濃度，但其準確(que)度與經(jing)驗(yan)(yan)有(you)關；另外(wai)，電(dian)(dian)泳(yong)也(ye)可能提供某些雜(za)質(zhi)污染的(de)(de)(de)(de)信(xin)息，但是(shi)(shi)同(tong)樣與經(jing)驗(yan)(yan)有(you)關。紫外(wai)分(fen)(fen)光光度儀檢(jian)(jian)測(ce)(ce)的(de)(de)(de)(de)是(shi)(shi)純(chun)度和(he)核(he)(he)酸(suan)含量(liang)，然(ran)而(er)，由于紫外(wai)分(fen)(fen)光光度儀不(bu)(bu)能確(que)保非常(chang)(chang)準確(que)，而(er)該儀器的(de)(de)(de)(de)靈敏(min)度又非常(chang)(chang)高(gao)，所以(yi)，提供的(de)(de)(de)(de)結(jie)果并不(bu)(bu)十分(fen)(fen)可信(xin)。一般講(jiang)，同(tong)時進行紫外(wai)和(he)電(dian)(dian)泳(yong)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)，綜合二(er)者(zhe)的(de)(de)(de)(de)結(jie)果，可以(yi)做出一個更合理的(de)(de)(de)(de)判斷。但由于這兩個方(fang)(fang)(fang)法都(dou)有(you)缺陷，所以(yi)，即使(shi)出現壞的(de)(de)(de)(de)結(jie)果能用(yong)(yong)(yong)于后(hou)(hou)續實(shi)(shi)驗(yan)(yan)而(er)好(hao)(hao)的(de)(de)(de)(de)結(jie)果卻不(bu)(bu)能用(yong)(yong)(yong)于后(hou)(hou)續實(shi)(shi)驗(yan)(yan)，也(ye)不(bu)(bu)用(yong)(yong)(yong)大(da)驚(jing)小怪。

6、 質粒電泳條帶

瓊(qiong)脂糖電(dian)泳(yong)進(jin)行(xing)鑒(jian)定質粒(li)(li)(li)DNA時，多數情(qing)況下你能(neng)看到(dao)三(san)(san)(san)條(tiao)(tiao)(tiao)帶，但(dan)不要認為你看到(dao)的(de)是(shi)(shi)超螺旋(xuan)(xuan)、線性(xing)和開(kai)環這(zhe)三(san)(san)(san)條(tiao)(tiao)(tiao)帶。堿法抽提(ti)得(de)到(dao)質粒(li)(li)(li)樣(yang)(yang)品(pin)中不含線性(xing)DNA，用EcoRI來線性(xing)化質粒(li)(li)(li)后再進(jin)行(xing)瓊(qiong)脂糖電(dian)泳(yong)，就會(hui)看到(dao)線性(xing)質粒(li)(li)(li)DNA的(de)位置(zhi)與這(zhe)三(san)(san)(san)條(tiao)(tiao)(tiao)帶的(de)位置(zhi)不一樣(yang)(yang)。其實這(zhe)三(san)(san)(san)條(tiao)(tiao)(tiao)帶以電(dian)泳(yong)速度的(de)快(kuai)慢而排序，分別是(shi)(shi)超螺旋(xuan)(xuan)、開(kai)環和復制中間體（即沒(mei)有(you)(you)(you)復制完全的(de)兩(liang)個質粒(li)(li)(li)連(lian)在了(le)一起）。如果你不小(xiao)心在溶液(ye)II加入后過度振蕩，會(hui)有(you)(you)(you)第(di)四條(tiao)(tiao)(tiao)帶，這(zhe)條(tiao)(tiao)(tiao)帶泳(yong)動得(de)較(jiao)慢，遠離這(zhe)三(san)(san)(san)條(tiao)(tiao)(tiao)帶，是(shi)(shi)20-100kb的(de)大(da)腸桿菌基因(yin)組DNA的(de)片斷(duan)。 非常偶然的(de)是(shi)(shi)，有(you)(you)(you)時候抽提(ti)到(dao)的(de)質粒(li)(li)(li)會(hui)有(you)(you)(you)7－10條(tiao)(tiao)(tiao)帶，這(zhe)是(shi)(shi)由于特殊的(de)DNA序列(lie)導致(zhi)了(le)不同程度的(de)超螺旋(xuan)(xuan)（超螺旋(xuan)(xuan)的(de)圈數不同）所致(zhi)。

7、 核酸的保存

純化后的核(he)酸(suan)，最后多使用水或者低濃度(du)緩沖液溶(rong)(rong)解(jie)；其中 RNA 以水為主，DNA 則多以弱(ruo)堿性(xing)的 Tris 或者 TE 溶(rong)(rong)解(jie)。經典的 DNA 溶(rong)(rong)解(jie)方法多提(ti)倡使用 TE 溶(rong)(rong)解(jie)，認為 EDTA 可以減少 DNA 被可能殘留下來的 DNase 降(jiang)解(jie)的風險；如果(guo)操(cao)作過程控制得(de)當，DNase 的殘留幾乎是可以忽略的，完(wan)全可以直(zhi)接使用 Tris 或者水 (pH 接近 7) 溶(rong)(rong)解(jie) DNA。基本上(shang)，核(he)酸(suan)在保存中的穩(wen)定性(xing)，與溫度(du)成反比，與濃度(du)成正比。

如(ru)果溫(wen)度合適，保(bao)存中(zhong)核(he)酸(suan)發(fa)(fa)生降解(jie)(jie)或者消失，首要(yao)原因是(shi)酶(mei)殘留導致的(de)(de)(de)(de)酶(mei)解(jie)(jie)，第(di)二個原因則是(shi)保(bao)存核(he)酸(suan)溶液的(de)(de)(de)(de) pH 值不合適導致的(de)(de)(de)(de)水解(jie)(jie) (RNA 在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)弱酸(suan)性(xing)(xing)更穩(wen)定，而 DNA 在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)弱堿性(xing)(xing)更合適)。還(huan)(huan)有(you)一個不為人(ren)重視的(de)(de)(de)(de)，就(jiu)(jiu)是(shi) EP 管對核(he)酸(suan)的(de)(de)(de)(de)影(ying)響。首先(xian)一定要(yao)堅信一點，那(nei)就(jiu)(jiu)是(shi)核(he)酸(suan)一定會與裝它的(de)(de)(de)(de)容器的(de)(de)(de)(de)接觸面發(fa)(fa)生反應，達到某(mou)種(zhong)均衡。EP 管的(de)(de)(de)(de)材(cai)質，首先(xian)可(ke)能(neng)(neng)吸附核(he)酸(suan)，其(qi)次還(huan)(huan)可(ke)以(yi)(yi)誘導核(he)酸(suan)的(de)(de)(de)(de)結構發(fa)(fa)生某(mou)些(xie)變(bian)化(hua)，如(ru)變(bian)性(xing)(xing)。在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)核(he)酸(suan)的(de)(de)(de)(de)濃(nong)度比(bi)較(jiao)高時，這(zhe)個現象可(ke)能(neng)(neng)觀察不到；當(dang)核(he)酸(suan)濃(nong)度很低時，則比(bi)較(jiao)明(ming)顯了。在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)低濃(nong)度的(de)(de)(de)(de)核(he)酸(suan)中(zhong)加入 Geletin,Glycogen,BSA 可(ke)以(yi)(yi)穩(wen)定核(he)酸(suan)，雖(sui)然已經為實(shi)驗所證(zheng)明(ming)，但(dan)許(xu)多(duo)實(shi)驗人(ren)員并(bing)沒有(you)將該建(jian)議(yi)當(dang)回事(shi)。現在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)制造(zao) EP 管的(de)(de)(de)(de)材(cai)料(liao)遠(yuan)多(duo)于過去。這(zhe)些(xie)新出現的(de)(de)(de)(de)材(cai)料(liao)，在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)強度、透(tou)明(ming)度等(deng)物(wu)理特征方面可(ke)能(neng)(neng)比(bi)原來的(de)(de)(de)(de)純 PP 材(cai)質要(yao)好許(xu)多(duo)，但(dan)其(qi)化(hua)學特征，尤其(qi)是(shi)對核(he)酸(suan)穩(wen)定性(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)可(ke)能(neng)(neng)影(ying)響，遠(yuan)沒有(you)研究透(tou)徹。正(zheng)如(ru)現在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)的(de)(de)(de)(de)質粒可(ke)以(yi)(yi)改造(zao)得越(yue)來越(yue)適用某(mou)些(xie)要(yao)求(qiu)一樣，其(qi)負面產物(wu)可(ke)能(neng)(neng)是(shi)，抽提的(de)(de)(de)(de)質粒電泳(yong)的(de)(de)(de)(de)構型(xing)(xing)(xing)越(yue)來越(yue)多(duo)：除了原來的(de)(de)(de)(de)三種(zhong)帶型(xing)(xing)(xing)外，還(huan)(huan)可(ke)能(neng)(neng)出現 denatured cc 、multimeric forms of cc 等(deng)等(deng)帶型(xing)(xing)(xing)。

8、 核(he)酸(suan)抽提中的溫(wen)度問(wen)題(ti)

核酸抽提(ti)中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)溫度(du)(du)問(wen)題，也(ye)是(shi)一個值(zhi)得(de)關注的(de)(de)(de)(de)(de)問(wen)題。首先(xian)要明確的(de)(de)(de)(de)(de)一點(dian)是(shi)，任(ren)何一個溫度(du)(du)條件(jian)，對(dui)某些(xie)(xie)方面有(you)利，同時也(ye)一定(ding)會有(you)不利的(de)(de)(de)(de)(de)一面。如沉淀，低(di)溫操(cao)作會提(ti)高(gao)得(de)率(lv)，但(dan)也(ye)會增加(jia)雜質的(de)(de)(de)(de)(de)殘留。任(ren)何一步操(cao)作該用什么溫度(du)(du)為好，應該是(shi)利弊權衡的(de)(de)(de)(de)(de)結(jie)果。基本上，除(chu)了(le)一些(xie)(xie)特(te)殊的(de)(de)(de)(de)(de)步驟，如消化等(deng)外，用室溫是(shi)最好的(de)(de)(de)(de)(de)選(xuan)擇。低(di)溫的(de)(de)(de)(de)(de)確可以減低(di)酶的(de)(de)(de)(de)(de)活性，但(dan)低(di)溫同時也(ye)降低(di)了(le)這(zhe)些(xie)(xie)酶被裂解液中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)試劑滅(mie)活或(huo)者抑制的(de)(de)(de)(de)(de)速度(du)(du)，此消彼長，沒有(you)辦(ban)法給出結(jie)論的(de)(de)(de)(de)(de)。