KASP（Kompetitive Allele-Specific PCR，競爭性等位(wei)基因特異(yi)性PCR）是一種(zhong)基于PCR的(de)基因分型(xing)技(ji)術，主要(yao)用于檢測單核苷酸多態性（SNP）和其他特定基因變異(yi)。廣泛應用于農業育種(zhong)、醫學研究、群體遺傳學等領(ling)域。

引(yin)物設(she)計開發流程(cheng)如下(xia)

1. 獲取SNP信息，要求兩親本在SNP位置的堿基序列不同，同時該SNP上游20bp、下游40bp無其他SNP, SNP信息可通過全基因組測序得到，也可通過重測序得到；
2. 提取親本DNA、F1代DNA
3. 引物設計：

• 從SNP所在堿基開始往上游數20bp作為左引物f，SNP的堿基作為左引物的第20個堿基，于是有左引物f1，f2;
• 使用引物設計軟件或引物設計網站（//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）固定左引物f，通過blast得到右引物R，產物大小需小于60bp；
• 左引物f1、f2分別加上接頭A1、A2（接頭序列A1：GAAGGTGACCAAGTTCATGCT，A2：GAAGGTCGGAGTCAACGGATT）序列為F1、F2，即F1=A1f1，F2=A2f2；
• 合成序列F1，F2，R，選用ULTRPAGE純化方式；

4. 將引物干粉溶解，按比例配制成Primer Mix
5. 引物篩選：每種引物每個親本及F1最少跑2個孔。
6. 擴增結束后使用熒光定量PCR讀帶：讀帶程序如下：
   25℃ for 5s + Plate Read。讀帶完成后，選定熒光類型FAM、HEX、ROX,選擇Allelic Discrimination進行分析
7. 挑選其中聚類明顯的引物作為候選標記。
8. 將候選標記用于群體，若聚類效果明顯則可作為KASP標記，聚類效果不明顯則不能作為標記。

 

一般來說，實驗初期需要選擇多個位點設計不同引物進行實際驗證，從中選出聚類效果明顯的作為最終的引物用于實驗。KASP 本身是一個非常依賴引物設計的技術，如果反復優化無果，很可能引物在 SNP 區位的設計可以進一步改善。

推薦產品：KASP PCR MixPlus P4041

 

配置反應體系

1. 模板DNA：通常每個反應加入2.5-25ng/ul高質量DNA可滿足分型需求。具體投入量根據實驗使用物種的基因組大小判斷，遵循大基因組高投入，小基因組低投入原則投入適當DNA。請盡量保持DNA濃度一致。
2. 引物：按比例混合 F1、F2、R 各為 10 μM 的 Primer Mix（體積比 1:1:2.5）
3. KASP PCR MixPlus : KASP PCR Mix、KASP Probe Mix 全部組分混合振蕩均勻

PCR擴增體(ti)系如下(xia)(10ul體(ti)系)

Component	Volume
DNA	25-250ng
KASP PCR MixPlus	5ul
Primer mix	0.76ul
超純水	補齊至10ul

 

陰性對照設置

為保證基因分(fen)型(xing)數(shu)據(ju)的(de)準確性，除(chu)測試樣(yang)品外，還應(ying)在PCR板上使用對(dui)(dui)照樣(yang)品。建議每個(ge)基因分(fen)型(xing)板上包(bao)含(han)兩(liang)個(ge)NTCs (無模板對(dui)(dui)照)。NTC孔的(de)熒光(guang)信號強度與模板DNA孔的(de)信號強度差異可以提高(gao)對(dui)(dui)基因分(fen)型(xing)數(shu)據(ju)有效性的(de)判(pan)定(ding)。通常(chang)NTC樣(yang)品的(de)信號值應(ying)接近(jin)原(yuan)點(dian)，NTC孔中觀(guan)察到的(de)任(ren)何擴(kuo)增(zeng)都表(biao)明存在污染或非特異性擴(kuo)增(zeng)，能夠(gou)輔助分(fen)型(xing)數(shu)據(ju)的(de)判(pan)讀(du)。

設定反應程序進行KASP反應

Stage	Temperature	Time	Number of Cycles
Hot-start Taq activation	95℃	1 min	1
Touchdown	95℃	15 sec	10
	60→54℃，-0.6℃/循環	15 sec
	72℃	20 sec
Amplification	95℃	15 sec	26-35
	54℃	15 sec
	72℃	20 sec
Read	30℃	60 sec	1

循(xun)環(huan)數(shu)建(jian)(jian)議(yi)根據物種基因組大小和投入量確定(ding)，如(ru)首次實驗無成熟程序，建(jian)(jian)議(yi)采取26個循(xun)環(huan)進(jin)行(xing)初(chu)始反應(ying)，后續逐次增加循(xun)環(huan)進(jin)行(xing)最適條件摸索。

若初(chu)始PCR擴增結束后未獲得明確基(ji)因(yin)型(xing)分簇，可以按(an)照擴增循(xun)環條件增加(jia)3個循(xun)環(94°C 20 sec，57°C 60 sec)，并(bing)再(zai)次讀取(qu)和(he)分析熒光(guang)信號值。若分簇結果(guo)仍不夠理想(xiang)，可以繼續(xu)增加(jia)PCR循(xun)環，直至觀察到(dao)緊密且分離良好的基(ji)因(yin)型(xing)分簇為止(zhi)。

熒光讀取

選(xuan)定熒光類型FAM、HEX、ROX,選(xuan)擇Allelic Discrimination進(jin)行(xing)分(fen)析（根據實(shi)際儀(yi)器進(jin)行(xing)操作）