1、 在提核酸前(qian)，對(dui)實驗樣品你(ni)應該知道什么？

樣品的核酸(suan)含(han)量(liang)、酶含(han)量(liang)、特殊雜質含(han)量(liang)。

絕大情況下，使用新鮮樣(yang)品(pin)(pin)可(ke)以獲得最好的(de)結果，但對一(yi)(yi)些雜質(zhi)含量高的(de)樣(yang)品(pin)(pin)，-20℃保(bao)(bao)存一(yi)(yi)天后(hou)抽提，可(ke)能會有更好的(de)效果。樣(yang)品(pin)(pin)如(ru)果因為某些原因必須先(xian)行保(bao)(bao)存，也要(yao)先(xian)簡化一(yi)(yi)下樣(yang)品(pin)(pin)：血液(ye)最好只保(bao)(bao)存有核(he)細胞；將(jiang)樣(yang)品(pin)(pin)分割(ge)后(hou)保(bao)(bao)存，避(bi)免反復凍融(rong)；如(ru)果實驗室不(bu)具(ju)備(bei)合(he)適(shi)的(de)保(bao)(bao)存條件，可(ke)將(jiang)樣(yang)品(pin)(pin)先(xian)裂解后(hou)再保(bao)(bao)存。

2、 怎(zen)樣選擇裂(lie)解方法？

⑴ 含蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)酶的裂解方(fang)法(fa)，可以(yi)認為是抽(chou)提基因(yin)(yin)組 DNA 的首(shou)選。某(mou)些樣(yang)品(pin)，如肌肉，即使是 RNA 抽(chou)提，也強烈建議使用含蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)酶的裂解液 (或者(zhe)在操(cao)作(zuo)中(zhong)的某(mou)個時候(hou)使用蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)酶消化蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)質) ，原因(yin)(yin)在于這些樣(yang)品(pin)中(zhong)的蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)質，是非(fei)常難以(yi)去除的。該方(fang)法(fa)是獲得(de)最大得(de)率和最高純度(du)的基礎。

⑵ 不(bu)(bu)使用蛋白酶的去污劑裂解方(fang)法(fa)，仍(reng)然在細胞基因組(zu) DNA 抽提(ti)方(fang)面有優勢，尤其是當(dang)得率和純度要求不(bu)(bu)是最高，而經(jing)濟性及操作(zuo)簡單很重要時。

① 高濃度蛋白質變性劑 (如 GIT、GuHCl 等) 的裂解方法，是抽提 RNA 的首選。高濃度蛋白質變性劑能快速破壞細胞膜，進而迅速抑制住細胞內的 RNA 酶，從而確保了 RNA 的完整性。除了極少量不適用該方法的樣品 – 主要是植物，其它絕大部分樣品的 RNA 的抽提，都可以以高濃度的蛋白質變性劑為基礎的。該方法也可用于基因組 DNA 抽提，非常快速簡單，但純度不是很高。
② 含 CTAB 的裂解液，幾乎成為富含多糖的樣品，如細菌、植物的基因組 DNA 抽提的首選裂解方法。該方法成功與否與兩個因素有關：一是 CTAB 的質量，二是洗滌的徹底程度。CTAB 的質量對裂解效率有很大的影響，而且，似乎還說不清楚原因，因為即使是同一公司生產的純度一樣的 CTAB，批號不同，效果就可能差別很大。洗滌去除 CTAB 要比其它的鹽難一些，同時， CTAB 的少量殘留也會對酶活性有巨大影響，所以洗滌是否徹底也是該方法成功與否的關鍵。裂解時的溫度，多使用 65℃；但如果發現降解嚴重或者得率太低，可以試一下 37℃ – 45℃ 這個相對低溫的區域。
③ SDS 堿裂(lie)解法(fa)(fa)是質粒(li)(li)抽提的(de)(de)(de)首選裂(lie)解方法(fa)(fa)，具有(you)快速、得率高、幾(ji)乎(hu)無基(ji)因組 DNA 污染的(de)(de)(de)特點。控(kong)制好裂(lie)解液(ye)(ye)/菌體的(de)(de)(de)比例和操作的(de)(de)(de)溫(wen)和是該方法(fa)(fa)成(cheng)功的(de)(de)(de)關鍵。蛋(dan)白質的(de)(de)(de)沉淀效率在(zai) 4℃會更好一(yi)些，所以(yi)(yi)，加入溶液(ye)(ye) III 后在(zai)4℃靜(jing)置(zhi)一(yi)段時間以(yi)(yi)及采用(yong)4℃離(li)心去蛋(dan)白質，都可(ke)以(yi)(yi)提高質量。該方法(fa)(fa)不一(yi)定要使用(yong) PC 純(chun)(chun)化，但(dan)結合 PC 純(chun)(chun)化，可(ke)以(yi)(yi)獲得純(chun)(chun)度很(hen)高的(de)(de)(de)質粒(li)(li)。RNA 的(de)(de)(de)去除可(ke)以(yi)(yi)靠在(zai)溶液(ye)(ye) I 中(zhong)加入 RNase A (100μg/ml) 或者在(zai)最(zui)后的(de)(de)(de)溶解液(ye)(ye)中(zhong)加入 RNase A (25 μg/ml) 來(lai)實現(xian)。總的(de)(de)(de)感覺是，在(zai)溶液(ye)(ye) I 中(zhong)使用(yong) RNase A，RNA 的(de)(de)(de)殘留少一(yi)些。不過，經典沉淀幾(ji)乎(hu)沒有(you)辦法(fa)(fa)徹底去除 RNA 殘留。另(ling)外，對大質粒(li)(li) (50 kb 以(yi)(yi)上)，該方法(fa)(fa)可(ke)能會有(you)問題(ti)。

3、 不同純(chun)化方法之間有(you)什(shen)么不同？

⑴ PC 抽提/醇沉淀方法，是一個永不過時的方法。穩定、可靠、經濟、方便。PC 抽提可以徹底去除蛋白質，醇沉淀可以去除鹽，對于一般的干凈的樣品 (雜質為蛋白質)，該方法完全可以獲得高質量的核酸。PC 抽提的關鍵是，一要混勻徹底，二要用量足夠。徹底混勻，才能確保苯酚與蛋白質的充分接觸，使蛋白質完全變性。許多人總是擔心混勻的劇烈程度是否會對核酸，尤其是基因組 DNA 造成破壞，實際上大可不必如此小心。劇烈的混勻操作，是會部分打斷大分子的基因組 DNA，但該破壞作用不會強烈到 DNA 變成 10kb 以內的小片段。手劇烈晃動混勻后，基因組 DNA 的片段，大部分會大于 20kb，這個大小，除了一些特別的要求外，對 PCR 和酶切，都是完全適用的。如果要求的片段非常大，如構建文庫用，則不能使用劇烈的混勻方法，而只能來回溫和顛倒混勻──此時的關鍵是：裂解液的比例要足夠大，使體系不要太粘稠。用量要足夠，是因為苯酚去除蛋白質是有一定的飽和度的，超過了該飽和度，裂解體系中的蛋白質不會被一次去除，必須靠多次抽提，方可徹底去除。另外，體系太粘稠的壞處是，蛋白質難以徹底去除，以及基因組 DNA 會斷裂得更厲害，所以要注意裂解液與樣品的比例。PC 抽提的另外一個用途是，利用酸性酚可以部分去除 DNA 的特點，在 RNA 抽提時獲得 DNA 殘留極少的 RNA。不過有一點要提醒的是，有些植物樣品，在去除某些雜質之前，是不能使用 PC 抽提的，否則核酸必定降解。總之，該方法的最大的問題是不適合大規模抽提。
⑵ 高鹽沉淀蛋白質/醇沉淀方法，與 PC 抽提方法相比，除了純度的穩定性可能要低一點外，該方法幾乎克服了 PC 抽提的所有缺點。更快、更輕松去除蛋白質所伴隨的好處是，可以用于大規模抽提，不足是純度 (蛋白質殘留) 不夠穩定。蛋白質的沉淀效率在 4℃會更好一些。
⑶ 介(jie)(jie)質(zhi)純(chun)化(hua)(hua)(hua)方(fang)法(fa)，是(shi)一個(ge)越來(lai)越受到(dao)重視的(de)方(fang)法(fa)。其最(zui)大(da)特(te)點是(shi)非(fei)常適合大(da)規(gui)模核(he)(he)酸(suan)抽提，并且因為(wei)受人為(wei)操作因素影響小，純(chun)度的(de)穩(wen)定(ding)(ding)性(xing)很高 (雖然(ran)純(chun)度不(bu)(bu)一定(ding)(ding)比(bi)PC 純(chun)化(hua)(hua)(hua)方(fang)法(fa)更(geng)高)。其致命(ming)弱點是(shi)樣品過(guo)量。介(jie)(jie)質(zhi)可(ke)以分(fen)為(wei)兩大(da)類(lei)，一類(lei)是(shi)柱(zhu)(zhu)(zhu)式(shi)(shi)的(de)，即(ji)介(jie)(jie)質(zhi)被預先(xian)裝填(tian)在(zai)下面是(shi)通的(de)柱(zhu)(zhu)(zhu)子里；另外一類(lei)則是(shi)顆(ke)粒狀 (如Glassmilk、磁性(xing)小珠等)。顆(ke)粒狀的(de)介(jie)(jie)質(zhi)的(de)純(chun)化(hua)(hua)(hua)操作與經典的(de)醇沉淀差(cha)別不(bu)(bu)大(da)，都是(shi)通過(guo)數次的(de)加液(ye)-倒(dao)液(ye)過(guo)程，干(gan)燥(zao)后，溶解即(ji)可(ke)獲得(de)純(chun)化(hua)(hua)(hua)好的(de)核(he)(he)酸(suan)。柱(zhu)(zhu)(zhu)式(shi)(shi)純(chun)化(hua)(hua)(hua)的(de)操作雖然(ran)也(ye)是(shi)有加液(ye)-倒(dao)液(ye)過(guo)程，但因為(wei)加入的(de)液(ye)體通過(guo)離(li)心(xin)后會(hui)進入另外一個(ge)離(li)心(xin)管中，與含有核(he)(he)酸(suan)的(de)柱(zhu)(zhu)(zhu)子完全是(shi)分(fen)開的(de)，所以洗(xi)滌(di)更(geng)徹底，操作更(geng)省力 (不(bu)(bu)用操心(xin)將核(he)(he)酸(suan)倒(dao)掉了，或者液(ye)體的(de)殘(can)留)。不(bu)(bu)過(guo)，介(jie)(jie)質(zhi)純(chun)化(hua)(hua)(hua)方(fang)法(fa)的(de)成本是(shi)最(zui)高的(de)，而目前核(he)(he)酸(suan)純(chun)化(hua)(hua)(hua)試劑盒(he)也(ye)多為(wei)此方(fang)法(fa)。

4、 醇的沉淀

⑴ 醇的沉淀，目的是使核酸從裂解體系中沉淀下來，從而實現核酸與其它雜質 – 主要是鹽 – 的分離。實際操作中，許多雜質也會與核酸一起被醇沉淀下來，尤其是當其它雜質的濃度也比較高的時候。醇的沉淀并不是非常特異性的，任何有機大分子及一些鹽，當濃度達到一定水平后，都可能同步被沉淀下來。如果核酸抽提的起始樣品是比較“臟”的，原則上不要使用低溫沉淀。低溫沉淀能提高沉淀效率：當核酸濃度很低時，效果明顯；當核酸濃度比較高時，效果不明顯，但卻會導致雜質的大大增加。TRIzol 提供的一個沉淀方案：一半異丙醇加一半高鹽溶液替代純粹的異丙醇，可以大大降低多糖殘留。
⑵ PEG、LiCl、CTAB 都可以(yi)(yi)用(yong)于核(he)酸(suan)沉(chen)淀。雖然它們遠沒有(you)醇沉(chen)淀的高(gao)使用(yong)頻(pin)率(lv)，但卻各有(you)特點。LiCl 可以(yi)(yi)沉(chen)淀 RNA 以(yi)(yi)去除 DNA，CTAB 可以(yi)(yi)從含多糖(tang)的裂解體系中將(jiang)核(he)酸(suan)沉(chen)淀下(xia)來。PEG 是(shi)沉(chen)淀病毒顆粒(li)的方便手段。

5、 怎樣去(qu)洗(xi)滌(di)沉(chen)淀？

洗滌首(shou)先一(yi)(yi)定(ding)(ding)要(yao)將沉淀懸浮(fu)起來；第二就(jiu)是(shi)要(yao)有(you)(you)一(yi)(yi)定(ding)(ding)的(de)(de)時(shi)間，尤其是(shi)當核酸(suan)(suan)(suan)沉淀比較大(da)時(shi) (使核酸(suan)(suan)(suan)沉淀最終蓬松)；第三是(shi)少量多(duo)(duo)次；第四則是(shi)去上(shang)清要(yao)徹底(di)(di)。教科書中(zhong)的(de)(de)操(cao)作(zuo)基本(ben)上(shang)都是(shi)“倒(dao)掉上(shang)清后(hou)(hou)倒(dao)置(zhi)在(zai)吸(xi)(xi)水紙上(shang)片刻”，這一(yi)(yi)描(miao)述本(ben)身沒(mei)有(you)(you)問(wen)題，且十分方便，但因(yin)為他來自國外，自然就(jiu)有(you)(you)了“水土不服”的(de)(de)問(wen)題。如果離心(xin)管是(shi)經過(guo)硅化的(de)(de)，因(yin)為液(ye)(ye)體幾乎(hu)不掛壁(bi)，所以(yi)(yi)上(shang)清可以(yi)(yi)去除得非常徹底(di)(di)；好的(de)(de)管子，即使沒(mei)有(you)(you)經過(guo)硅化，殘留(liu)量也(ye)(ye)非常少，也(ye)(ye)沒(mei)有(you)(you)什么(me)問(wen)題；差(cha)的(de)(de)管子，液(ye)(ye)體的(de)(de)掛壁(bi)非常可觀，其殘留(liu)量多(duo)(duo)到會(hui)影(ying)(ying)響(xiang)后(hou)(hou)續的(de)(de)實驗。唯一(yi)(yi)不受管子質(zhi)量影(ying)(ying)響(xiang)的(de)(de)操(cao)作(zuo)，就(jiu)是(shi)倒(dao)掉液(ye)(ye)體后(hou)(hou)再短暫離心(xin)，將殘液(ye)(ye)用移液(ye)(ye)器吸(xi)(xi)出。一(yi)(yi)定(ding)(ding)要(yao)牢(lao)記(ji)的(de)(de)是(shi)，殘液(ye)(ye)中(zhong)都含有(you)(you)上(shang)一(yi)(yi)步操(cao)作(zuo)中(zhong)的(de)(de)雜質(zhi)，其殘留(liu)量與混勻程度、核酸(suan)(suan)(suan)沉淀的(de)(de)大(da)小都有(you)(you)關。揮發時(shi)去掉的(de)(de)是(shi)乙醇(chun)，雜質(zhi)是(shi)不會(hui)被揮發去除的(de)(de)。另(ling)外，核酸(suan)(suan)(suan)沉淀的(de)(de)大(da)小及裂(lie)解(jie)液(ye)(ye)的(de)(de)裂(lie)解(jie)能力也(ye)(ye)決定(ding)(ding)了洗滌的(de)(de)強(qiang)度。沉淀越(yue)(yue)大(da)，裂(lie)解(jie)液(ye)(ye)的(de)(de)裂(lie)解(jie)能力越(yue)(yue)強(qiang)，洗滌越(yue)(yue)要(yao)徹底(di)(di)：放置(zhi)時(shi)間相對要(yao)長一(yi)(yi)點(dian)，洗滌次數也(ye)(ye)要(yao)考慮增加。最關鍵的(de)(de)，洗滌一(yi)(yi)定(ding)(ding)要(yao)用室溫的(de)(de) 75% 乙醇(chun)。

6、 怎樣(yang)保存核酸？

純(chun)化(hua)后的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)核(he)(he)(he)酸(suan)(suan)，最后多使用水(shui)或者低濃度(du)(du)(du)緩沖液溶(rong)(rong)解(jie)；其(qi)中(zhong) RNA 以(yi)(yi)水(shui)為主，DNA 則多以(yi)(yi)弱(ruo)堿性的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de) Tris 或者 TE 溶(rong)(rong)解(jie)。經典的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de) DNA 溶(rong)(rong)解(jie)方法多提(ti)倡使用 TE 溶(rong)(rong)解(jie)，認為 EDTA 可以(yi)(yi)減少 DNA 被可能(neng)殘留下來的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de) DNase 降解(jie)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)風險；如果(guo)操作過程控(kong)制得當(dang)，DNase 的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)殘留幾乎是可以(yi)(yi)忽略的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)，完全可以(yi)(yi)直(zhi)接(jie)使用 Tris 或者水(shui) (pH 接(jie)近 7) 溶(rong)(rong)解(jie) DNA。基本上，核(he)(he)(he)酸(suan)(suan)在保(bao)存(cun)(cun)中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)穩(wen)(wen)定(ding)性，與(yu)(yu)溫度(du)(du)(du)成(cheng)反比，與(yu)(yu)濃度(du)(du)(du)成(cheng)正(zheng)比。如果(guo)溫度(du)(du)(du)合(he)適，保(bao)存(cun)(cun)中(zhong)核(he)(he)(he)酸(suan)(suan)發(fa)生(sheng)降解(jie)或者消失，首(shou)要原因是酶(mei)殘留導致的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)酶(mei)解(jie)，第二個(ge)(ge)原因則是保(bao)存(cun)(cun)核(he)(he)(he)酸(suan)(suan)溶(rong)(rong)液的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de) pH 值不(bu)合(he)適導致的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)水(shui)解(jie) (RNA 在弱(ruo)酸(suan)(suan)性更穩(wen)(wen)定(ding)，而 DNA 在弱(ruo)堿性更合(he)適)。還有一(yi)個(ge)(ge)不(bu)為人(ren)重視的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)，就(jiu)是 EP 管對核(he)(he)(he)酸(suan)(suan)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)影響(xiang)。首(shou)先一(yi)定(ding)要堅(jian)信一(yi)點，那就(jiu)是核(he)(he)(he)酸(suan)(suan)一(yi)定(ding)會與(yu)(yu)裝它(ta)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)容器(qi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)接(jie)觸面發(fa)生(sheng)反應，達(da)到(dao)(dao)某種(zhong)均衡。EP 管的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)材質(zhi)(zhi)，首(shou)先可能(neng)吸附核(he)(he)(he)酸(suan)(suan)，其(qi)次(ci)還可以(yi)(yi)誘導核(he)(he)(he)酸(suan)(suan)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)結(jie)構發(fa)生(sheng)某些變化(hua)，如變性。在核(he)(he)(he)酸(suan)(suan)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)濃度(du)(du)(du)比較高時(shi)，這個(ge)(ge)現象可能(neng)觀(guan)察不(bu)到(dao)(dao)；當(dang)核(he)(he)(he)酸(suan)(suan)濃度(du)(du)(du)很低時(shi)，則比較明顯了。如抽(chou)提(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)質(zhi)(zhi)粒電泳(yong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)構型越來越多，除了原來的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)三種(zhong)帶型外，還可能(neng)出(chu)現 denatured cc 、multimeric forms of cc 等等帶型。在低濃度(du)(du)(du)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)核(he)(he)(he)酸(suan)(suan)中(zhong)加入 Geletin,Glycogen,BSA 可以(yi)(yi)穩(wen)(wen)定(ding)核(he)(he)(he)酸(suan)(suan)，雖(sui)然(ran)已經為實驗所證明，但許(xu)多實驗人(ren)員并沒有將(jiang)該(gai)建議(yi)當(dang)回事。

7、 核酸質量檢測

將抽(chou)提(ti)好的(de)(de)(de)(de)核(he)(he)(he)酸(suan)(suan)直(zhi)接用(yong)于(yu)后(hou)續的(de)(de)(de)(de)實(shi)驗(yan)(yan)(yan)，是(shi)(shi)(shi)唯一(yi)(yi)(yi)可靠(kao)的(de)(de)(de)(de)檢測(ce)(ce)方(fang)法；除此之外的(de)(de)(de)(de)檢測(ce)(ce)方(fang)法，都是(shi)(shi)(shi)相(xiang)對的(de)(de)(de)(de)，而且(qie)并不(bu)十(shi)分可信(xin)。目(mu)前用(yong)于(yu)正(zheng)式(shi)實(shi)驗(yan)(yan)(yan)前檢測(ce)(ce)核(he)(he)(he)酸(suan)(suan)質量的(de)(de)(de)(de)方(fang)法，一(yi)(yi)(yi)是(shi)(shi)(shi)電(dian)泳，二(er)是(shi)(shi)(shi)紫外分光(guang)光(guang)度儀(yi)。電(dian)泳檢測(ce)(ce)的(de)(de)(de)(de)主要(yao)是(shi)(shi)(shi)核(he)(he)(he)酸(suan)(suan)的(de)(de)(de)(de)完整性和大小，只要(yao)核(he)(he)(he)酸(suan)(suan)不(bu)是(shi)(shi)(shi)太(tai)小或者(zhe)太(tai)大 (超出電(dian)泳分離范圍)，該方(fang)法還是(shi)(shi)(shi)非常(chang)(chang)可信(xin)的(de)(de)(de)(de)；電(dian)泳還可以用(yong)于(yu)估計核(he)(he)(he)酸(suan)(suan)的(de)(de)(de)(de)濃度，但其(qi)準確度與經(jing)驗(yan)(yan)(yan)有關；另外，電(dian)泳也可能提(ti)供(gong)某(mou)些雜質污染的(de)(de)(de)(de)信(xin)息，但是(shi)(shi)(shi)同(tong)樣與經(jing)驗(yan)(yan)(yan)有關。紫外分光(guang)光(guang)度儀(yi)檢測(ce)(ce)的(de)(de)(de)(de)是(shi)(shi)(shi)純度和核(he)(he)(he)酸(suan)(suan)含量，然而，由于(yu)紫外分光(guang)光(guang)度儀(yi)不(bu)能確保非常(chang)(chang)準確，而該儀(yi)器的(de)(de)(de)(de)靈敏(min)度又非常(chang)(chang)高，所以，提(ti)供(gong)的(de)(de)(de)(de)結果(guo)并不(bu)十(shi)分可信(xin)。一(yi)(yi)(yi)般講，同(tong)時進行紫外和電(dian)泳檢測(ce)(ce)，綜合二(er)者(zhe)的(de)(de)(de)(de)結果(guo)，可以做出一(yi)(yi)(yi)個更合理的(de)(de)(de)(de)判斷。但由于(yu)這兩個方(fang)法都有缺陷，所以，即使出現(xian)壞的(de)(de)(de)(de)結果(guo)能用(yong)于(yu)后(hou)續實(shi)驗(yan)(yan)(yan)而好的(de)(de)(de)(de)結果(guo)卻不(bu)能用(yong)于(yu)后(hou)續實(shi)驗(yan)(yan)(yan)，也不(bu)用(yong)大驚小怪。