1 PCR產物的電泳檢測時間
　　一般為(wei)48h以內，有些最好于(yu)當日電泳檢(jian)測，大于(yu)48h后帶型(xing)不(bu)規則甚致消失。

2 假陰性，不出現擴增條帶，應該怎么辦？
　　PCR反應(ying)(ying)的(de)(de)關鍵環(huan)(huan)節有①模板核酸的(de)(de)制備(bei)，②引物的(de)(de)質量與特異性，③酶的(de)(de)質量及用(yong)量， ④PCR循環(huan)(huan)條件。尋找(zhao)原因亦應(ying)(ying)針對上述環(huan)(huan)節進行(xing)分析研究。

3 出現假陽性怎么辦？
　　出現的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。
　　引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現假陽性。需重新設計引物。
　　靶(ba)序(xu)列或(huo)擴增產物(wu)(wu)的(de)(de)交叉污染(ran)：這種(zhong)污染(ran)有(you)兩種(zhong)原因(yin)(yin)：一是整(zheng)個基(ji)因(yin)(yin)組或(huo)大片段(duan)的(de)(de)交叉污染(ran)，導致(zhi)假(jia)陽性(xing)。這種(zhong)假(jia)陽性(xing)可(ke)用(yong)(yong)以(yi)(yi)下方法(fa)解決：操作時應小心輕(qing)柔，防(fang)止(zhi)將(jiang)靶(ba)序(xu)列吸入加樣槍內或(huo)濺出(chu)(chu)離心管外。除(chu)酶及不能(neng)耐(nai)高溫的(de)(de)物(wu)(wu)質外，所(suo)有(you)試劑(ji)或(huo)器(qi)材(cai)均應高壓消毒。所(suo)用(yong)(yong)離心管及進樣槍頭等(deng)均應一次性(xing)使用(yong)(yong)。必(bi)要時，在(zai)加標本(ben)前，反應管和(he)試劑(ji)用(yong)(yong)紫外線照射，以(yi)(yi)破壞(huai)存(cun)在(zai)的(de)(de)核酸。二是空(kong)氣(qi)中(zhong)的(de)(de)小片段(duan)核酸污染(ran)，這些小片段(duan)比靶(ba)序(xu)列短，但(dan)有(you)一定(ding)的(de)(de)同源性(xing)。可(ke)互(hu)相拼接，與引(yin)物(wu)(wu)互(hu)補后，可(ke)擴增出(chu)(chu)PCR產物(wu)(wu)，而(er)導致(zhi)假(jia)陽性(xing)的(de)(de)產生，可(ke)用(yong)(yong)巢(chao)式(shi)PCR方法(fa)來減輕(qing)或(huo)消除(chu)。

4 出現(xian)非特異(yi)性擴增帶怎么辦(ban)？

PCR擴增(zeng)(zeng)后出(chu)現(xian)(xian)的(de)條帶與預計(ji)的(de)大小(xiao)不(bu)(bu)一致，或(huo)大或(huo)小(xiao)，或(huo)者同(tong)時(shi)出(chu)現(xian)(xian)特異(yi)性(xing)(xing)擴增(zeng)(zeng)帶 與非特異(yi)性(xing)(xing)擴增(zeng)(zeng)帶。非特異(yi)性(xing)(xing)條帶的(de)出(chu)現(xian)(xian)，其原(yuan)因：一是(shi)引(yin)(yin)物(wu)與靶(ba)序列(lie)不(bu)(bu)完全互補、 或(huo)引(yin)(yin)物(wu)聚合(he)形成二聚體。二是(shi)Mg2+離子濃度(du)過(guo)高、退火(huo)溫(wen)(wen)(wen)度(du)過(guo)低(di)，及PCR循(xun)(xun)環(huan)次(ci)數(shu) 過(guo)多有(you)關。其次(ci)是(shi)酶(mei)的(de)質和量(liang)(liang)，往往一些來源的(de)酶(mei)易(yi)出(chu)現(xian)(xian)非特異(yi)條帶而另一來源的(de)酶(mei) 則不(bu)(bu)出(chu)現(xian)(xian)，酶(mei)量(liang)(liang)過(guo)多有(you)時(shi)也會出(chu)現(xian)(xian)非特異(yi)性(xing)(xing)擴增(zeng)(zeng)。其對(dui)策(ce)有(you)：必要時(shi)重新設計(ji)引(yin)(yin) 物(wu)。減低(di)酶(mei)量(liang)(liang)或(huo)調換(huan)另一來源的(de)酶(mei)。降低(di)引(yin)(yin)物(wu)量(liang)(liang)，適(shi)當增(zeng)(zeng)加模板(ban)量(liang)(liang)，減少循(xun)(xun)環(huan)次(ci) 數(shu)。適(shi)當提高退火(huo)溫(wen)(wen)(wen)度(du)或(huo)采(cai)用二溫(wen)(wen)(wen)度(du)點法(93℃變性(xing)(xing)，65℃左右退火(huo)與延伸(shen))。

4.1 怎樣(yang)檢測(ce)引物(wu)是否合成(cheng)的(de)好？

可以在DHPLC上看(kan)一(yi)下(xia)(xia)，80度全變性的(de)(de)情況下(xia)(xia)一(yi)條帶就可以了(le)(le)。如(ru)果合成的(de)(de)不(bu)好，產物(wu)自然不(bu)特異(yi)了(le)(le)。

4.2 使用了比較好的Taq酶，且引物沒有出現問題，考慮如下幾點：
　　1。模板是否過量？
　　2。退火溫度是否可降高1－2度？
　　3。Mg的濃度(du)控制在(zai)1.5mM?

5 出現片狀拖帶或涂抹帶怎么辦？
　　PCR擴增有時出現涂抹帶(dai)或片狀帶(dai)或地毯樣帶(dai)。其(qi)原因往往由于(yu)酶量過(guo)(guo)(guo)多或酶的(de)質量 差，dNTP濃(nong)度(du)過(guo)(guo)(guo)高，Mg2+濃(nong)度(du)過(guo)(guo)(guo)高，退火(huo)溫度(du)過(guo)(guo)(guo)低(di)，循(xun)環(huan)次數過(guo)(guo)(guo)多引(yin)起。其(qi)對策(ce)有：減少酶量，或調(diao)換另一來源的(de)酶。②減少dNTP的(de)濃(nong)度(du)。適(shi)當降低(di)Mg2+濃(nong) 度(du)。增加模板量，減少循(xun)環(huan)次數。