Multiplex Probe qPCR Mix Plus U?實驗方案 1

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多克隆瘧原蟲株系中特定單倍型藥物反應表型的剖析：

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1. 實驗材料和(he)試劑準備

- 選擇3個疑似多克隆(long)的P. falciparum株系，例(li)如：IPC_3445 (MRA-1236), IPC_5202 (MRA-1240), IPC_6403 (MRA-1285)。

- 準備O+型人類紅細胞(bao)和(he)RPMI 1640培養基，以(yi)及所需的(de)補充劑和(he)抗生素。

- 準備氯(lv)喹(kui)、甲氟喹(kui)和哌拉喹(kui)藥(yao)物儲備溶液。

- 準備用于DNA提(ti)取、基因分型(xing)和PCR反應的相(xiang)關試劑。

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2. 瘧原蟲株系的體外(wai)培養

- 使用標(biao)準體外培養條件，將瘧(nve)原蟲株系在37°C、5% CO2和90% N2氣氛下培養。

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3. 多克(ke)隆性質的確認(ren)

- 提取每(mei)個瘧原蟲株(zhu)系的DNA，并在24個高度多態性SNP位點進行基因分型。

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4. 單(dan)一寄生蟲譜(pu)系的分離(li)

- 通過(guo)限制稀釋(shi)法，將瘧原蟲(chong)株系在96孔板中進行稀釋(shi)，以分離單個受感染的(de)紅(hong)細胞。

- 使用SYBR? Green I熒(ying)光染料檢測寄生蟲DNA，確定陽性孔。

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5. 基因分(fen)型和系(xi)統發育(yu)分(fen)析

- 對每個陽性孔中的寄(ji)生蟲進行基因(yin)分型，使用(yong)24-SNP分子條形碼法(fa)。

- 構建(jian)系統發育(yu)樹，分析不同寄生(sheng)蟲譜(pu)系之(zhi)間的關(guan)系。

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6. 體外抗(kang)瘧藥敏(min)感性(xing)測試

- 使用SYBR? Green Antimalarial Assay對氯喹(kui)(kui)、甲氟喹(kui)(kui)和(he)哌拉喹(kui)(kui)的敏感性進(jin)行測試。

- 測定(ding)每種藥物的半(ban)最大抑制濃度（IC50）。

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7. 寄(ji)生(sheng)蟲存(cun)活(huo)試驗

- 對于CQ和PPQ，使用環階段存(cun)活試(shi)驗(RSA)和哌拉喹(kui)存(cun)活試(shi)驗(PSA)來確定寄(ji)生蟲對藥物的存(cun)活率。

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8. 抗瘧藥抗性位點的測序和基因分型

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8.1 目標基因的選擇

選(xuan)擇已知與(yu)抗瘧藥抗性相(xiang)關(guan)的基因(yin)，包括但不限(xian)于：

- 氯(lv)喹(kui)抗性相關基因(yin)：pfcrt（瘧原蟲氯(lv)喹(kui)抗性轉(zhuan)運蛋白）

- 甲氟喹(kui)和哌拉喹(kui)抗性(xing)相關基因：pfmdr-1（瘧(nve)原蟲多藥耐(nai)藥1基因）

- 蒿甲醚(mi)抗性相關基(ji)因：K13基(ji)因

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8.2 DNA提取和PCR擴增

- 使用DNA提取(qu)試劑盒從瘧原蟲(chong)培養物中提取(qu)基因組(zu)DNA。

- 設計特異性(xing)引物，針(zhen)對上述(shu)基因(yin)進行PCR擴增。例如，使用五組引物覆蓋整個pfcrt基因(yin)。

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8.3 SNPs檢(jian)測(ce)

- 使(shi)用Sanger測序(xu)(xu)技術對PCR產物進(jin)行(xing)測序(xu)(xu)，以檢測pfcrt、pfmdr-1和K13基因(yin)中的單(dan)核苷酸多態性（SNPs）。

- 利用(yong)測序結果分析軟件（如(ru)DNASTAR Lasergene）進行序列數據的分析和可(ke)視化。

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8.4 拷貝數變異檢測

- 使用ΔΔCT方法確定pfmdr-1和pfmp-2（瘧(nve)原蟲血漿膜蛋白2基因(yin)）的拷貝(bei)數，這些基因(yin)與甲(jia)氟喹和哌拉喹抗性相關。

- 通過實時(shi)定量PCR（qPCR）技術，在同(tong)一(yi)孔中同(tong)時(shi)擴增(zeng)目(mu)標基(ji)因和內(nei)參(can)基(ji)因（如β-微管蛋白基(ji)因或(huo)絲氨酸tRNA連(lian)接(jie)酶基(ji)因）。

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8.5 qPCR實驗操作

- 準備主混合液，包含Multiplex Probe qPCR Mix Plus U?（GDSBio, P2701）、無(wu)菌水、目(mu)標基(ji)因和內(nei)參基(ji)因的(de)預配(pei)方Taqman SNP檢測。

- 將主混(hun)合液分配到96孔(kong)PCR板中，每(mei)個樣本包含(han)75 ng的寄(ji)生蟲DNA。

- 使(shi)用CFX96實時PCR儀(yi)器(qi)進(jin)行樣品擴(kuo)增，并使(shi)用基因表達模塊分(fen)析(xi)結果(guo)。

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8.6 數據分析

- 將(jiang)目標基因的(de)拷(kao)(kao)貝(bei)數與(yu)內(nei)參基因的(de)拷(kao)(kao)貝(bei)數進行(xing)比(bi)較，以確定(ding)相對拷(kao)(kao)貝(bei)數。

- 使(shi)用已知拷(kao)貝數(shu)的標準樣品（如3D7株系）進(jin)行校準。

- 對于pfmdr-1和pfmp-2基因，分(fen)析是否存在基因擴增(zeng)現象(xiang)，這可能與抗藥性發展有(you)關。

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8.7 結果記錄和解(jie)釋

- 記錄所有測序和(he)qPCR結果，包(bao)括基因型和(he)拷貝數(shu)。

- 解釋(shi)測(ce)序和拷貝數(shu)變異數(shu)據(ju)，分析它們與體外抗(kang)藥性表型(xing)之間的潛在聯(lian)系。

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8.8 質量控制

- 包(bao)括使用(yong)已(yi)知基(ji)因型的實驗室(shi)控(kong)制株(zhu)系作為(wei)陽性和(he)陰(yin)性對(dui)照(zhao)。

- 對每個實驗步驟進行重復，以確保數據的(de)準確性和可重復性。

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以(yi)上步驟(zou)提供了詳細的實(shi)驗(yan)(yan)流程，用于檢測和(he)分析與(yu)抗瘧藥抗性(xing)相關的基(ji)因(yin)變異。實(shi)驗(yan)(yan)操作應嚴格遵(zun)守實(shi)驗(yan)(yan)室規程和(he)生(sheng)物安全指南，確保數據的準確性(xing)和(he)可(ke)靠性(xing)。

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9. 數據分析

- 使用GraphPad Prism軟件分析(xi)IC50值(zhi)和存(cun)活(huo)率(lv)數據。

- 應用統計方法比(bi)較(jiao)不同寄(ji)生(sheng)蟲譜系之間的差異。

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10. 結果解釋和報告

- 解釋實(shi)驗結果(guo)，討論不同寄生蟲譜系的抗藥性表型。

- 撰寫實驗(yan)報告，包括(kuo)實驗(yan)方法、結果和討論。

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11. 安全性和質量控制(zhi)

- 確(que)保實驗操作(zuo)符合生物安全標準。

- 使(shi)用已(yi)知的(de)實驗室控制株系作為陽性和陰性對照。

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12. 實驗材料的保(bao)存和記(ji)錄

- 記錄所有實驗步驟(zou)和(he)結果。

- 保存(cun)所有原始數據和實驗(yan)材料，以備后續分析和驗(yan)證。

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這個實驗方案提(ti)供了一個全面的(de)框(kuang)架，用于研究(jiu)P. falciparum株系的(de)多(duo)克(ke)隆性(xing)和抗藥性(xing)表型。實驗操作應嚴格遵(zun)守實驗室(shi)規程和生(sheng)物安全指南。

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Multiplex Probe qPCR Mix Plus U?

貨號：P2701，P2702，P2703，P2704?

產品簡介?

Multiplex Probe qPCR Mix Plus U?是(shi)用(yong)(yong)(yong)于探(tan)(tan)針法實時定(ding)量?PCR?的(de)?2×濃縮預混液(ye)，使用(yong)(yong)(yong)時?只需加入模板、引(yin)物(wu)和探(tan)(tan)針即可(ke)進(jin)行反(fan)應(ying)。本(ben)品含有(you)抗體技術修飾(shi)的(de)熱啟動酶(mei)?Hotstart Taq?DNA?聚(ju)合(he)酶(mei)，配合(he)東盛特制的(de)?Real Time PCR Buffer，不僅有(you)效(xiao)抑(yi)制引(yin)物(wu)二聚(ju)體和其(qi)他(ta)非?特異性擴增(zeng)，而且(qie)能(neng)夠(gou)提高(gao)擴增(zeng)效(xiao)率，可(ke)以進(jin)行多重探(tan)(tan)針?qPCR?反(fan)應(ying)。該試劑引(yin)入?了(le)?dUTP/UDG?防污染(ran)系統，可(ke)以在?PCR?反(fan)應(ying)前清除含?dUTP?的(de)?PCR?產物(wu)，有(you)效(xiao)避(bi)免(mian)因?擴增(zeng)產物(wu)的(de)交叉污染(ran)對(dui)定(ding)量的(de)影響。本(ben)品方便用(yong)(yong)(yong)于制備?IVD?分子診斷試劑盒，對(dui)靶基因定(ding)?量準確、可(ke)信度高(gao)，重復(fu)性好(hao)。本(ben)品可(ke)搭(da)配?TaqMan?等(deng)各(ge)類熒光探(tan)(tan)針使用(yong)(yong)(yong)，與(yu)常見定(ding)量?PCR?儀完美兼容，如?ABI、Roche、Bio-Rad?等(deng)。?

產品用途

探針法基因表達分析

多重低拷貝基因檢測

產品特點

可進行多重探(tan)針(zhen)法熒(ying)光定量PCR

適合常見定量機型

高效熱啟動技術帶來高特異和可(ke)重復的擴(kuo)增(zeng)

含(han)?dUTP/UDG?防污(wu)染系(xi)統

穩(wen)定性高，適合大規模檢(jian)測

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