FS? Mix Direct for Tissue

Cat. #：P2071b，P2072b

產品簡介

FS??Mix Direct for Tissue是適合組(zu)織樣(yang)(yang)本(ben)(ben)擴增(zeng)(zeng)的(de)(de)2×濃(nong)縮(suo)快速高效PCR預混合溶液(ye)，含有FS? Taq DNA聚合酶、dNTP混合物(wu)、緩沖液(ye)等PCR擴增(zeng)(zeng)必需(xu)組(zu)分(fen)（模板(ban)與(yu)引物(wu)除外）。使(shi)用(yong)(yong)時(shi)(shi)，僅(jin)需(xu)在擴增(zeng)(zeng)體系中加(jia)入簡單處理(li)(li)后的(de)(de)樣(yang)(yang)本(ben)(ben)處理(li)(li)液(ye)和引物(wu)即可(ke)進行PCR，從(cong)而可(ke)以極(ji)大(da)地簡化操作過(guo)程，縮(suo)短操作時(shi)(shi)間，降低污染（加(jia)樣(yang)(yang)次(ci)數減少(shao)(shao)）。FS??Mix Direct for Tissue的(de)(de)反應體系經過(guo)優化處理(li)(li)，高靈敏度的(de)(de)FS??Taq DNA聚合酶確保處理(li)(li)液(ye)中的(de)(de)微量樣(yang)(yang)本(ben)(ben)得到(dao)高效擴增(zeng)(zeng)。本(ben)(ben)產品不用(yong)(yong)進行繁瑣的(de)(de)DNA提取，最大(da)限度減少(shao)(shao)實驗誤差和交叉污染；同時(shi)(shi)依靠(kao)特殊的(de)(de)緩沖體系增(zeng)(zeng)強PCR擴增(zeng)(zeng)的(de)(de)特異(yi)性，保證(zheng)擴增(zeng)(zeng)效果(guo)(guo)與(yu)DNA模板(ban)擴增(zeng)(zeng)效果(guo)(guo)同樣(yang)(yang)可(ke)靠(kao)。

FS??Taq DNA聚合酶是根據蛋白工程原理，以Taq DNA聚合酶為基礎，研發設計的新一代DNA聚合酶。本產品具有類似KOD酶的快速擴增能力，延伸速度為20s/kb（70~75℃，簡單模板可達5s/kb）。是普通Taq DNA聚合酶的3倍，可縮短一半以上的擴增時間；同時具備Taq DNA聚合酶擴增效率高、適應性廣等優點。FS??Taq DNA聚合酶使用方法與普通Taq DNA聚合酶基本相同，只需注意適當縮短延伸時間。該酶具有5'→3'聚合酶活性，無3'→5'外切酶活性。擴增產物具有3'-dA突出端，可直接用于TA克隆。

產品組成

本產(chan)品(pin)分體(ti)系中包(bao)含(han)溴(xiu)酚藍、不含(han)溴(xiu)酚藍兩類。體(ti)系中包(bao)含(han)溴(xiu)酚藍的(de)產(chan)品(pin)，PCR擴增(zeng)產(chan)物可直接電泳檢測。這兩類產(chan)品(pin)的(de)擴增(zeng)性能無差異。如無特別(bie)說明(ming)提供體(ti)系中包(bao)含(han)溴(xiu)酚藍的(de)包(bao)裝。

保存條件

-20℃保存2年。

質量控制

純(chun)度檢(jian)測：經質量檢(jian)測，產(chan)品不(bu)含(han)脫氧核(he)糖(tang)(tang)核(he)酸(suan)(suan)內(nei)切酶(mei)、脫氧核(he)糖(tang)(tang)核(he)酸(suan)(suan)外切酶(mei)和核(he)糖(tang)(tang)核(he)酸(suan)(suan)酶(mei)污染。

功(gong)能檢測：PCR方法檢測無(wu)宿主殘余DNA，能有(you)效(xiao)擴增(zeng)人基因組中的(de)單拷(kao)貝基因。

應用舉例

1.?處理樣品

組織：取3-5mg組織置于1.5ml離心管中，加(jia)(jia)入180 μl Extraction?Solution，充分渦(wo)旋(xuan)振蕩，95℃溫浴10min。加(jia)(jia)入20 μl?Neutralization?Solution，充分渦(wo)旋(xuan)振蕩，5,000rpm離心2min，取0.5-2 μl上清進行擴增。

頭發：取兩根(gen)帶毛(mao)囊的頭發(fa)，剪下(xia)帶毛(mao)囊的發(fa)根(gen)放(fang)入1.5ml離心(xin)管中，加(jia)入180 μl Extraction?Solution，充分(fen)渦旋振(zhen)蕩，95℃溫浴10min。加(jia)入20 μl?Neutralization?Solution，充分(fen)渦旋振(zhen)蕩，5000rpm離心(xin)2min，取0.5-2 μl上清進行擴增。

口腔拭子：取樣前30min內(nei)請勿進(jin)食及(ji)飲水，使用無菌棉簽在口(kou)腔內(nei)擦拭10次。將棉球(qiu)剪(jian)下置于1.5ml離心管中，加(jia)入180 μl Extraction? Solution，充分渦旋振蕩，95℃溫浴10min。加(jia)入20 μl?Neutralization?Solution，充分渦旋振蕩，5,000rpm離心2min，取0.5-2 μl上(shang)清進(jin)行(xing)擴(kuo)增。

培養細胞：如果是懸浮培養細胞直接取1×10³-10⁴當量的細胞加(jia)入(ru)到(dao)50 μl?PCR反(fan)應體系中即可。如果是(shi)貼壁培養細胞，取3-5mg細胞組織置于(yu)1.5ml離心管中，加(jia)入(ru)180 μl Extraction?Solution，充分渦旋(xuan)振蕩，95℃溫浴10min。加(jia)入(ru)20 μl?Neutralization?Solution，充分渦旋(xuan)振蕩，5,000rpm離心2min，取0.5-2 μl上清進(jin)行擴增。

血液、淋巴液DNA病毒：取100 μl血清(qing)(qing)或淋巴液(ye)至1.5ml離心管中，加(jia)入(ru)180 μl Extraction?Solution，充(chong)(chong)分渦(wo)旋振(zhen)蕩，95℃溫(wen)浴10min。加(jia)入(ru)20 μl?Neutralization? Solution，充(chong)(chong)分渦(wo)旋振(zhen)蕩，12,000rpm離心10min，取0.5-2 μl上清(qing)(qing)進行擴增。

2.?配制反應體系

請于冰上配置反應體系，體系大小與組分用量與添加順序可調整：

[1]?引物終濃(nong)度建議范圍：0.1-1 μM。特異(yi)性差時可降低濃(nong)度，效率低時可提高濃(nong)度。

[2]?可單獨訂購超(chao)純(chun)水（Cat. #：P9021/P9022/P9023）。

[3]?可單獨訂購25mM MgCl₂（Cat. #：P9031）和PCR Enhancer（Cat. #：P9041）。

3.?設定反應程序進行PCR反應

大多數模板(ban)的快速(su)擴增條件：

[1]?退火溫度應根據Tm值(zhi)較低的(de)引物來設。

[2]?延伸時間按20 sec/kb來設最佳。

1kb簡單模板的快速擴增條件：

由(you)于(yu)1kb簡(jian)單模板的二(er)級結(jie)構簡(jian)單，且長度較短(duan)，可同時(shi)(shi)縮(suo)短(duan)變(bian)性、退火時(shi)(shi)間(jian)至15s，延伸時(shi)(shi)間(jian)20s，以(yi)實現(xian)快速擴增。

4.?分析結果

反應產物可直接進行瓊脂糖凝膠電泳，通過凝膠成像設備觀察目的條帶的擴增情況。如有需要，可進行割膠回收。無產物或產物量少的改進措施有：1調整退火溫度；2減少抑制劑的影響，如提取的基因組DNA中含有抑制擴增的成分，需要高倍稀釋（1: 10000）后使用；3采用乙醇沉降洗脫，提高模板DNA的純度；4使用PCR添加劑，如PCR Enhancer（Cat. #：P9041）、MgCl₂（Cat. #：P9031）等可提高產量。

操作注意事項

處理(li)(li)的(de)組織(zhi)樣本往往不(bu)會(hui)完全溶(rong)解，這是正常(chang)現象。溶(rong)解在處理(li)(li)液中(zhong)的(de)組織(zhi)樣本足夠滿(man)足FS??Mix Direct for Tissue擴增的(de)需要。

室(shi)溫(wen)下FS??Taq DNA聚合酶有一定(ding)的活性，為避免發生(sheng)非(fei)特異(yi)性擴增，請(qing)于冰(bing)上配置反(fan)應體系，并且最后添加模板DNA。

延(yan)伸(shen)時間視片段(duan)(duan)長度而定。一般情(qing)況，≤500bp目的片段(duan)(duan)延(yan)伸(shen)15s，500bp-1kb延(yan)伸(shen)20s，＞1kb延(yan)伸(shen)時間按20s/kb計算(suan)。

FS? Taq DNA聚(ju)合酶具有脫(tuo)氧核(he)苷酸轉移酶活性，因此在PCR產物3’末端通常會加上一個多余的(de)脫(tuo)氧腺嘌(piao)呤(ling)核(he)苷，可進(jin)行TA克隆。

FS??Mix Direct for Tissue也可采用常(chang)規程序擴增。

引物設計注意事項

引(yin)(yin)物(wu)長(chang)度一般在15-30個(ge)堿基之(zhi)間；上下(xia)游引(yin)(yin)物(wu)3’末端避(bi)(bi)免互(hu)補，避(bi)(bi)免出(chu)現3個(ge)以上重復的G或(huo)C，或(huo)出(chu)現發(fa)夾結(jie)構，否則會產生非特異性(xing)擴增；GC含量(liang)控制(zhi)在40-60%，且上下(xia)游引(yin)(yin)物(wu)GC含量(liang)盡量(liang)接(jie)近；Tm值(zhi)控制(zhi)在55-65℃之(zhi)間，且上下(xia)游引(yin)(yin)物(wu)Tm值(zhi)盡量(liang)接(jie)近，額外附(fu)加序列(lie)（酶切位點、修飾等）是非模(mo)板匹配序列(lie)，不參與Tm值(zhi)計算。

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