通用RNA提取試劑盒

產品組分

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需要自備的溶液

●??氯仿

●??無水乙醇

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產品說明

通用RNA提取試劑盒是經過改進開發的新一代產品，提高了裂解液的裂解能力和提取的靈敏度，通過在特定適宜的條件下特異、可逆地結合RNA，而各種蛋白質和其他雜質均可被去除掉，同時改進的硅基質膜增強了對RNA的吸附能力，得到的RNA純度更好，質量更高。該試劑盒可從各種細胞或組織中快速提取總RNA，每個吸附柱每次可處理50–100 mg?組織或5×10⁶?細胞(bao)，可同(tong)(tong)時處(chu)理大量不同(tong)(tong)樣品，一(yi)個小(xiao)時內(nei)即可完(wan)成(cheng)反應。提(ti)取的總RNA沒有DNA和(he)蛋(dan)白的污染，可用于(yu)Northern blot、Dot blot、polyA?篩選、體外翻譯(yi)、RNase保護分析和(he)分子(zi)克隆等。

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保存條件

溶液(ye)RL應在2-8℃避光保(bao)存，其他(ta)溶液(ye)和純化柱室溫保(bao)存。

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注意事項---------------------------------------------------------------------------------------------------------
●??初次(ci)使用溶液RPI和溶液RW前(qian)，需按比例加(jia)入(ru)無(wu)(wu)水乙(yi)醇(chun)。18 ml溶液RPI中加(jia)入(ru)12 ml無(wu)(wu)水乙(yi)醇(chun)（3:2），12 ml溶液RW中加(jia)入(ru)48 ml無(wu)(wu)水乙(yi)醇(chun)（1:4）。

●??嚴防操(cao)作環境、使用的(de)容器、耗材(cai)和試劑(ji)的(de)RNase污染。操(cao)作過(guo)程(cheng)中勤換手套。

●??使用本產品提(ti)取(qu)的RNA一般(ban)不含有DNA污染。在極少數情況下(xia)（與組織(zhi)pH值等相關(guan)），如(ru)果(guo)有DNA污染而(er)又必(bi)須(xu)去(qu)除，則可以用RNase-free的DNase處理樣品。

●??請(qing)嚴格(ge)遵照操作步(bu)驟(zou)操作。

●??不同(tong)起始材料的用量及溶液RL的用量不同(tong)（參見下表），過多(duo)或(huo)過少的使用量都可能影響RNA的質(zhi)量或(huo)產(chan)量。若起始材料量很(hen)(hen)少，RNA預(yu)計(ji)產(chan)量很(hen)(hen)低，在異丙醇沉(chen)淀時，可加入20mg/ml的肝糖原溶液0.5-1 μl促進RNA沉(chen)淀。

●??有關RNA的吸光度說(shuo)明如下：

260nm、320nm、230nm、280nm下的(de)吸光度(du)分別代表核酸、背景（溶液渾(hun)濁度(du)）、鹽(yan)濃度(du)和蛋白質等有機物的(de)污(wu)染(ran)程(cheng)度(du)，質量較好的(de)RNA的(de)R值應在1.8-2.0之間，當(dang)R<1.8時，溶液中的(de)蛋白質等有機物的(de)污(wu)染(ran)比較明顯；當(dang)>2.2時，說明RNA已(yi)經被水解成單核苷酸。

●??RNA濃度=（OD₂₆₀-OD₃₂₀）*稀釋倍數*0.04 μg/μl。

操作步驟---------------------------------------------------------------------------------------------------------

第一次使用前應在溶(rong)液(ye)?RPI、溶(rong)液(ye)?RW中(zhong)加(jia)入無水乙醇，加(jia)入量請參見瓶上標簽(qian)。

1. ?樣品處理

●?組(zu)織(zhi)：將組(zu)織(zhi)在液氮中磨碎(sui)。每(mei)50–100 mg組(zu)織(zhi)加1 ml溶液RL，用勻漿儀進行勻漿處理。樣(yang)品體(ti)積(ji)不應(ying)超過溶液RL體(ti)積(ji)的十分之一。

●?單層培養細胞：直接在培養板中加入溶液RL裂解細胞，每10 cm^2?面積(ji)加1 ml溶液RL。用(yong)取樣器抽打幾次(ci)。

●??溶液RL的(de)加(jia)入量(liang)根據培(pei)養(yang)瓶面(mian)積決(jue)定(ding)，不(bu)(bu)是(shi)由細胞數(shu)決(jue)定(ding)。如果加(jia)量(liang)不(bu)(bu)足，可能(neng)導致提(ti)取(qu)的(de)RNA中有DNA污染。

c. ?細胞懸液：離心取細胞，棄上清。每5–10×10⁶動物細(xi)胞(bao)(bao)和植物細(xi)胞(bao)(bao)加(jia)入1 ml溶液(ye)RL。加(jia)溶液(ye)RL前不要(yao)洗滌細(xi)胞(bao)(bao)，以免降(jiang)解mRNA。

2. ?將勻漿樣品在(zai)15–30℃放置5 min，使得(de)核酸蛋白復合物完全分離(li)。

3. ?可選步驟：4℃ 12,000 rpm (~13,400×g)?離心5分鐘，取上清，轉入一個新的(de)無RNase的(de)離心管(guan)中。

●??如果樣品中(zhong)(zhong)含有較多蛋白、脂肪、多糖(tang)或肌肉、植(zhi)物結(jie)節部分(fen)等，可加此步驟離心去除(chu)。離心得(de)到(dao)的沉淀(dian)中(zhong)(zhong)包括細(xi)胞外(wai)膜、多糖(tang)、高分(fen)子量DNA，RNA存(cun)在于上清溶液中(zhong)(zhong)。

（如樣品含有較(jiao)多(duo)多(duo)糖(tang)多(duo)酚(fen)，請增加(jia)以下步驟(zou)，在上清液中加(jia)入0.2×上清液體(ti)積的(de)5 M NaCl及1×上清液體(ti)積的(de)酚(fen)/氯仿（1:1），混勻，12000 rpm?離心5-10 min?，取上清液加(jia)入等(deng)體(ti)積氯仿，混勻，12000 rpm?離心5-10 min，至第4步。）

4. ?加入(ru)200 μl氯仿，蓋好管(guan)蓋，劇烈振(zhen)蕩15 s，室溫(wen)放置3 min。

5. ?4℃ 12,000 rpm離心10 min，樣品會分成三層，從上至下依次是：無色的(de)水相，白色的(de)中(zhong)間層和黃(huang)色的(de)有(you)機相，RNA主要存在于(yu)水相中(zhong)，水相的(de)體(ti)積(ji)約為(wei)所用溶液RL試(shi)劑的(de)60%。把水相轉移到(dao)新管中(zhong)，進行下一步操作。注意不(bu)要吸(xi)到(dao)中(zhong)間層。

●??第一(yi)次(ci)使(shi)用前應在溶(rong)液?RPI、溶(rong)液RW中加入(ru)無(wu)水乙醇，加入(ru)量請(qing)參(can)見瓶上標(biao)簽。

6. ?緩慢加入0.5?倍體積無水乙醇，混勻（此時可能會出現沉淀）。將得到溶液和沉淀一起轉入純化柱中，4℃ 12,000 rpm離心30 s。4℃ 12,000 rpm離心30 s，棄掉收集管中的廢液。
●??若溶液體積(ji)大于純化柱容積(ji)（700 μl），可分兩次離心(xin)。

7. ?向純化柱中加入500 μl溶液RPI（使用前請先檢查是否已加入乙醇），4℃ 12,000 rpm離心30 s，棄廢液。????

8. ?向純化柱中加入500 μl溶液RW（使用前請先檢查是否已加入乙醇），室(shi)溫靜置(zhi)2 min，?4℃ 12,000 rpm離心30 s，棄(qi)廢液。

9. ?向純化柱中加入(ru)500 μl溶(rong)液RW，室溫靜置2分鐘，4℃ 12,000 rpm離心30 s，去除(chu)殘余液體。

10. ?將純化(hua)柱放入2ml收集管中，4℃ 12,000 rpm離心2 min，去除(chu)殘余液(ye)體(ti)。

●??此(ci)步驟的目的是將純化(hua)柱中殘余的漂(piao)洗(xi)液(ye)去除(chu)，離(li)心(xin)后將純化(hua)柱在(zai)室溫放(fang)置(zhi)片刻，或置(zhi)于超凈工作臺上(shang)通風片刻，以(yi)充分晾干。如果有漂(piao)洗(xi)液(ye)殘留，可能會影(ying)響(xiang)后續的RT等實驗操作。

11. ?將純化柱轉入一個新的離心管中，加30–100 μl RNase-free ddH₂O，室(shi)溫放置2 min，4℃ 12,000 rpm離(li)心(xin)2 min。

●??洗脫緩沖液體積不應少于30 μl，體積過小影響回收效率。且RNA應保存(cun)在-70℃（-80℃），以防(fang)降解(jie)。

●??如果(guo)想提(ti)高RNA得率，可(ke)重復上步操(cao)作(zuo)一次，合(he)并兩次得到(dao)的溶(rong)液。

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