TRAzol

產品說明

TRAzol可以(yi)(yi)從(cong)動物組織(zhi)、植物材料(liao)、各種微生(sheng)物以(yi)(yi)及培養細胞(bao)等(deng)組織(zhi)材料(liao)中提取總RNA。樣品(pin)在TRAzol中能夠充分(fen)被裂解，在加入氯仿離心(xin)后(hou)(hou)，溶(rong)液會(hui)形(xing)成(cheng)上(shang)(shang)清層(ceng)(ceng)、中間層(ceng)(ceng)和有機(ji)層(ceng)(ceng)（下層(ceng)(ceng)），RNA分(fen)布在上(shang)(shang)清層(ceng)(ceng)中，收集上(shang)(shang)清層(ceng)(ceng)后(hou)(hou)，經異丙醇(chun)沉淀便(bian)可以(yi)(yi)回收得到總RNA。經本制品(pin)提取的(de)(de)總RNA純度高(gao)，基本不含蛋白質及基因組DNA，提取的(de)(de)RNA可以(yi)(yi)直接用(yong)于Northern雜(za)交(jiao)、斑點雜(za)交(jiao)、mRNA純化、體外翻譯、RNA分(fen)解酶的(de)(de)保護分(fen)析、RT-PCR、構建cDNA文庫等(deng)各種分(fen)子生(sheng)物學實驗。

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產品組分

需要自(zi)備氯仿(fang)、異丙醇(chun)、RNase-free 75%乙醇(chun)、DEPC處理水（R2041/R2042）

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保存條件

室溫運(yun)輸，2-8℃避光保存。

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注意事項

● ??TRAzol具有腐(fu)蝕(shi)性，操作(zuo)過程中應做好防(fang)護，避免直接接觸皮膚或吸入口鼻。沾染(ran)后應立(li)即用大量清(qing)水(shui)沖洗，必要時(shi)請(qing)就醫處理。

● ??嚴防操作環境、使用的(de)容器、耗(hao)材(cai)和試劑的(de)RNase污染。操作過程中勤換手套(tao)。

● ??根(gen)據起始材料量的(de)不(bu)同使(shi)用(yong)不(bu)同體積的(de)溶液(ye)（見下表）。過多或過少(shao)的(de)使(shi)用(yong)量都可(ke)能影響RNA的(de)質量或產量。若起始材料量很(hen)少(shao)，RNA預計產量很(hen)低，在異丙醇沉淀時，可(ke)加入20 mg/ml肝糖原溶液(ye)0.5-1 μl促(cu)進RNA沉淀。

● ??不(bu)同起始材(cai)料試劑用量(liang)及TRAzol用量(liang)。

● ??使用本產品提取(qu)的RNA一般不含有DNA污染。在極少數情況下（與組織pH值等相關），如(ru)果有DNA污染而又必須(xu)去(qu)除，則可以用RNase-free的DNase處(chu)理樣品。

● ??防(fang)止DNA污(wu)染方法：a.?減少(shao)樣(yang)本起始用量，如(ru)將(jiang)100 mg的植(zhi)物組織減少(shao)為50 mg，將(jiang)30 mg的動物組織減少(shao)為10 mg；

????????????????????? b.?在加入(ru)TRAzol之后加入(ru)5-10 ul 3M NaAc(pH5.2)。

● ??請嚴(yan)格遵照操作(zuo)步驟(zou)操作(zuo)。

●? ?有關RNA的吸光度(du)說(shuo)明(ming)如下：

260 nm、320 nm、230 nm、280 nm下的吸光度分別代表了核酸、背景（溶液渾濁度）、鹽濃度和蛋白質等有機物的吸光度值。OD₂₆₀/OD₂₈₀（R）體現了RNA中的(de)(de)(de)蛋(dan)白質(zhi)(zhi)等有(you)(you)機(ji)物的(de)(de)(de)污(wu)染(ran)程(cheng)度(du)，質(zhi)(zhi)量較好的(de)(de)(de)RNA的(de)(de)(de)R值應(ying)在1.8-2.0之間，當R<1.8時，溶液中的(de)(de)(de)蛋(dan)白質(zhi)(zhi)等有(you)(you)機(ji)物的(de)(de)(de)污(wu)染(ran)比較明顯(xian)；當R>2.2時，說明RNA已經被(bei)水解成了單核(he)苷酸。在對核(he)酸進行(xing)吸光度(du)檢(jian)測時，需(xu)要注意(yi)稀釋液應(ying)使用TE Buffer。

●? ?RNA濃度=（OD₂₆₀-OD₃₂₀）×稀釋倍數×0.04 μg/μl

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操作步驟

1.??????實驗樣品的研磨和勻漿

A.?貼壁培養細胞

倒出培養液，用1X PBS清洗一次，每10 cm²生長的(de)培養(yang)細(xi)(xi)胞(bao)中加(jia)入1ml的(de)TRAzol，水平(ping)放置(zhi)片刻，使(shi)裂(lie)解液(ye)(ye)均(jun)勻分布于(yu)細(xi)(xi)胞(bao)表(biao)面并裂(lie)解細(xi)(xi)胞(bao)，然后使(shi)用移液(ye)(ye)槍吹打細(xi)(xi)胞(bao)使(shi)其脫落（對于(yu)貼壁牢固的(de)培養(yang)細(xi)(xi)胞(bao)可用細(xi)(xi)胞(bao)刮勺(shao)剝離細(xi)(xi)胞(bao)）。將內含細(xi)(xi)胞(bao)的(de)裂(lie)解液(ye)(ye)轉移至(zhi)離心管(guan)中，用移液(ye)(ye)槍反復吹吸直至(zhi)裂(lie)解液(ye)(ye)中無明顯沉淀。室溫靜置(zhi)5 min。

B.?懸浮培養細胞

將懸浮培養細胞連同培養液一起倒入離心管中，8,000 rpm，4℃離心2 min，棄上清，向每10⁷個細(xi)胞中(zhong)加入l-2 ml的TRAzol。用移液槍反復吹吸直至裂解液中(zhong)無明顯沉(chen)淀，室溫靜置5 min。

C.?動物(wu)組織、植物(wu)材料樣品

將(jiang)超低溫凍結(jie)的(de)RNA提取(qu)樣品(pin)稱量(liang)(liang)(liang)后迅速轉(zhuan)移(yi)至(zhi)用液(ye)(ye)氮(dan)預冷(leng)的(de)研(yan)(yan)(yan)(yan)缽中(zhong)(zhong)，用研(yan)(yan)(yan)(yan)杵(chu)研(yan)(yan)(yan)(yan)磨(mo)組織(zhi)，其(qi)間(jian)不斷(duan)加入(ru)(ru)液(ye)(ye)氮(dan)，直至(zhi)研(yan)(yan)(yan)(yan)磨(mo)成(cheng)(cheng)(cheng)粉(fen)末(mo)狀（無(wu)明顯的(de)可(ke)(ke)見顆粒，如果(guo)沒有(you)研(yan)(yan)(yan)(yan)磨(mo)徹底會影響RNA的(de)收率和質量(liang)(liang)(liang)）。對(dui)于普通(tong)的(de)RNA提取(qu)樣品(pin)，可(ke)(ke)以(yi)向研(yan)(yan)(yan)(yan)缽中(zhong)(zhong)加入(ru)(ru)適(shi)量(liang)(liang)(liang)的(de)TRAzol，將(jiang)研(yan)(yan)(yan)(yan)磨(mo)成(cheng)(cheng)(cheng)粉(fen)末(mo)狀的(de)樣品(pin)完(wan)(wan)全(quan)覆蓋，然后室(shi)溫靜(jing)置(zhi)，直至(zhi)樣品(pin)完(wan)(wan)全(quan)融化，再用研(yan)(yan)(yan)(yan)杵(chu)繼續(xu)研(yan)(yan)(yan)(yan)磨(mo)至(zhi)裂解液(ye)(ye)呈(cheng)透明狀。對(dui)于特殊樣品(pin)，如肝、脾、骨(gu)及軟骨(gu)等，可(ke)(ke)以(yi)將(jiang)研(yan)(yan)(yan)(yan)磨(mo)成(cheng)(cheng)(cheng)粉(fen)末(mo)狀的(de)樣品(pin)加入(ru)(ru)到含有(you)適(shi)量(liang)(liang)(liang)的(de)TRAzol的(de)勻(yun)(yun)漿(jiang)管中(zhong)(zhong)，把勻(yun)(yun)漿(jiang)管置(zhi)于冰浴中(zhong)(zhong)進行(xing)勻(yun)(yun)漿(jiang)，直至(zhi)勻(yun)(yun)漿(jiang)液(ye)(ye)呈(cheng)無(wu)顆粒透明狀。將(jiang)勻(yun)(yun)漿(jiang)液(ye)(ye)轉(zhuan)移(yi)至(zhi)離心(xin)管中(zhong)(zhong)，室(shi)溫靜(jing)置(zhi)5 min。12,000 rpm 4 ℃離心(xin)5 min，小(xiao)心(xin)吸取(qu)上清液(ye)(ye)，移(yi)入(ru)(ru)新的(de)離心(xin)管中(zhong)(zhong)（切勿吸取(qu)沉(chen)淀）。

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2.??????Total RNA的提取

1??向上述步驟(zou)中(zhong)的勻漿(jiang)裂(lie)解液中(zhong)加入氯仿（TRAzol的1/5體積量），蓋(gai)(gai)緊離心管蓋(gai)(gai)，用力振蕩（氯仿沸點(dian)低、易揮發，振蕩時應(ying)小心離心管蓋(gai)(gai)突然(ran)彈開）。待充分乳(ru)化溶液呈乳(ru)白狀(zhuang)（無分相現象）后，再室溫靜(jing)置2 min。

2? 12,000 rpm 4 ℃離心10 min。

3??從(cong)離心(xin)機(ji)中(zhong)小心(xin)取出離心(xin)管，此時(shi)勻漿液(ye)分(fen)為三層，即：無色的(de)(de)上清(qing)液(ye)、中(zhong)間的(de)(de)白色層及帶有顏色的(de)(de)下層有機(ji)相，吸(xi)取上清(qing)液(ye)轉移(yi)至另一新的(de)(de)離心(xin)管中(zhong)（切忌吸(xi)出白色中(zhong)間層）。

（如樣(yang)品含有較(jiao)多多糖(tang)多酚(fen)，請增(zeng)加以下(xia)步驟：在上(shang)(shang)清液(ye)(ye)中加入(ru)0.2X上(shang)(shang)清液(ye)(ye)體積(ji)的5 M NaCl及1X上(shang)(shang)清液(ye)(ye)體積(ji)的酚(fen)/氯仿（1:1），混(hun)勻(yun)，12000 rpm離(li)心5-10 min?，取(qu)上(shang)(shang)清液(ye)(ye)加入(ru)等(deng)體積(ji)氯仿，混(hun)勻(yun)，12000 rpm?離(li)心?5-10 min，至第(di)4步。）

4??向上(shang)清中加(jia)入等體積的異(yi)丙醇，上(shang)下(xia)顛倒離心管充分混勻后，在(zai)15-30℃下(xia)靜(jing)置10 min。

5? 12,000 rpm 4℃離心(xin)(xin)10 min。一(yi)般在離心(xin)(xin)后，試管(guan)底部會出現沉淀。

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3.??????RNA沉淀的清洗

小心(xin)(xin)棄去上(shang)清(qing)，緩慢地(di)沿(yan)離心(xin)(xin)管(guan)壁(bi)加入75％的(de)乙(yi)醇1 ml（切勿(wu)觸及沉淀），輕輕上(shang)下顛倒洗(xi)滌離心(xin)(xin)管(guan)管(guan)壁(bi)，12,000 rpm，4 ℃離心(xin)(xin)2 min后(hou)小心(xin)(xin)棄去乙(yi)醇（為了更好地(di)控制RNA中的(de)鹽離子含量(liang)，應(ying)盡(jin)量(liang)除凈乙(yi)醇），重(zhong)復(fu)洗(xi)滌一次。

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4.??????RNA的溶解

室溫(wen)干(gan)燥(zao)沉淀(dian)(dian)2-5 min（不可以離心(xin)或加熱干(gan)燥(zao)，否則(ze)RNA將會很難溶解），加入適量的RNase-free水(shui)溶解沉淀(dian)(dian)，必要時可用移液槍輕(qing)輕(qing)吹(chui)打(da)沉淀(dian)(dian)，待RNA沉淀(dian)(dian)完全(quan)溶解后于-80℃保(bao)存(cun)。