RT-PCR Kit（逆轉錄試劑盒）

產品說明

RT-PCR Kit(逆轉錄試劑(ji)盒）是專為兩(liang)步法(fa)RT-PCR第一(yi)(yi)步實驗配制的、具(ju)(ju)有高靈敏(min)度的RT-PCR反應系統。該系統合理配備了與cDNA第一(yi)(yi)鏈合成反應相關的各種組分，優化的體(ti)系保證了M-MLV具(ju)(ju)有高效的逆轉錄酶(mei)活性，所得cDNA對后續(xu)的PCR或定量PCR實驗兼容性好，可用于檢測(ce)(ce)稀有基因的表(biao)達(da)、從(cong)極少數細(xi)胞中定量檢測(ce)(ce)特定mRNA的表(biao)達(da)水(shui)平、克隆特定基因的cDNA片段等。

M-MLV逆(ni)轉(zhuan)錄(lu)酶是由(you)一(yi)個71 kD的單亞(ya)基組成的重組型DNA逆(ni)轉(zhuan)錄(lu)聚合(he)酶。可以(yi)催化(hua)以(yi)RNA或DNA：RNA雜交鏈為模板的互補DNA?的聚合(he)反應。本(ben)酶經修飾RNase H活性比普通的逆(ni)轉(zhuan)錄(lu)酶要弱很多，因此在合(he)成第一(yi)鏈cDNA的過(guo)程中，可保證RNA的降(jiang)解(jie)程度較低，從而(er)使得率提(ti)高。

產品組分

R1011可(ke)進行(xing)20次(ci)逆轉錄(lu)反(fan)應,R1012可(ke)進行(xing)100次(ci)逆轉錄(lu)反(fan)應（20 μl?標(biao)準PCR反(fan)應體系，每次(ci)使用?M-MLV 1μl）。

M-MLV?儲存液

20 mM Tris-HCl (pH 7.5)

200 mM NaCl

0.1 mM EDTA

1 mM DTT

0.01% NP-40

50% glycerol

?

5xfirst-strand buffer?成分

250 mM Tris-HCl (pH 8.3 at 25℃)

375 mM KCl

15 mM MgCl2

50 mM DTT

?

質量檢測

逆轉錄酶活性檢測

使用(yong)[32P]dCTP作為標記，200 U的(de)(de)?M-MLV以(yi)1μg、1.2 kb的(de)(de)RNA為模板進逆轉錄反(fan)應，最低可得到120ng的(de)(de)cDNA，所得cDNA長(chang)(chang)度?>?全(quan)長(chang)(chang)的(de)(de)90%。

核酸外切酶活性檢測

混(hun)合(he)50ng的(de)(de)標記DNA?或RNA與200U M-MLV在(zai)1×反(fan)應(ying)緩(huan)沖液體系中，37℃溫(wen)浴1 h，檢測DNA和RNA降解都不到(dao)總量的(de)(de)1%。

?

適用范圍

第一鏈(lian)cDNA?合(he)成

cDNA文庫構建

RT-PCR

引物延伸

3'和5' RACE

?

注意事項

l??成功的(de)(de)cDNA合(he)成來(lai)自高(gao)質(zhi)量(liang)的(de)(de)RNA。高(gao)質(zhi)量(liang)的(de)(de)RNA至少應(ying)保證全(quan)長的(de)(de)完整性并且不(bu)含逆轉錄酶(mei)的(de)(de)抑制劑(ji)，如EDTA或?SDS。用(yong)(yong)于cDNA合(he)成反應(ying)的(de)(de)溶液(ye)試(shi)劑(ji)盡(jin)可能用(yong)(yong)DEPC進行處理(li)，并在(zai)高(gao)壓(ya)滅(mie)(mie)菌后(hou)使(shi)用(yong)(yong)。有些試(shi)劑(ji)不(bu)能用(yong)(yong)高(gao)壓(ya)滅(mie)(mie)菌處理(li)時，首先用(yong)(yong)經(jing)過滅(mie)(mie)菌的(de)(de)器具、水(shui)等配制溶液(ye)后(hou)，再將(jiang)溶液(ye)進行過濾除菌處理(li)。

l??為了增(zeng)加(jia)貯存(cun)RNA樣(yang)品(pin)的(de)穩定(ding)性，可(ke)(ke)以將RNA溶解在(zai)去離子的(de)甲(jia)酰胺(an)中，存(cun)于(yu)(yu)-70℃。用于(yu)(yu)保存(cun)?RNA?的(de)甲(jia)酰胺(an)一(yi)定(ding)不能含有(you)降(jiang)解RNA的(de)雜(za)物。來源于(yu)(yu)胰臟的(de)RNA至少可(ke)(ke)以在(zai)甲(jia)酰胺(an)中保存(cun)一(yi)年。當準(zhun)備使用RNA時，可(ke)(ke)以使用下(xia)列(lie)方法沉淀RNA：加(jia)入NaCl至0.2 M同時加(jia)入4倍體積的(de)乙(yi)醇(chun)，室溫放置(zhi)3-5 min，10,000 rpm離心(xin)5 min。

l??在(zai)(zai)逆轉錄反(fan)應(ying)中(zhong)經常加(jia)入(ru)RNase抑制(zhi)劑(ji)(ji)（RNasin）以增加(jia)cDNA合(he)成的(de)長度(du)和(he)產量。在(zai)(zai)第一鏈合(he)成反(fan)應(ying)中(zhong)，RNase抑制(zhi)劑(ji)(ji)在(zai)(zai)緩沖液和(he)還原劑(ji)(ji)（如?DTT）存在(zai)(zai)的(de)條件下加(jia)入(ru)，因為cDNA合(he)成前的(de)過程會使抑制(zhi)劑(ji)(ji)變(bian)性，從而釋放出RNase。但(dan)是(shi)RNase抑制(zhi)劑(ji)(ji)僅防止RNase A，B，C?對RNA的(de)降解，并(bing)不(bu)能防止皮(pi)膚(fu)上的(de)RNase，因此盡管使用(yong)了RNase抑制(zhi)劑(ji)(ji)，也要小心不(bu)要從手指上引入(ru)RNase。

l??較高的(de)(de)保溫(wen)溫(wen)度有助于RNA二級結構(gou)的(de)(de)打開(kai)，增加反(fan)應的(de)(de)產量。

l??使用簡單的RNA純化方法即可獲得(de)滿(man)足RT-PCR反應的RNA，但為了保證實(shi)驗的成(cheng)功率，建議使用GTC法（異硫氰(qing)酸胍法）制備的高純度RNA。

l??為防止RNA降解，應(ying)盡量避免反(fan)復凍融，最好保存于-70℃。

l??最佳(jia)的(de)(de)PCR反(fan)應(ying)條(tiao)件，因PCR擴增儀(yi)的(de)(de)不同而不同，所以在(zai)使用(yong)您(nin)的(de)(de)樣品之前(qian)最好先試做一(yi)下control反(fan)應(ying)，以確定最佳(jia)的(de)(de)PCR反(fan)應(ying)條(tiao)件。

l??cDNA產物應置于-20℃保存。

l??當(dang)以cDNA為模板進行(xing)PCR之前(qian)，使用RNase H處理(li)cDNA，可以提高PCR反應的靈敏度。

?

操作步驟

1?在冰浴(yu)的(de)無菌離心管中配制下列混合物

1-5μg RNA

1μl Oligo(dT)₁₅?或(huo)Random primer，

補RNase-free ddH₂O至13.4μl；

2進行變性退火反應

70℃溫浴5 min,

簡短離心后冰(bing)浴5 min；

3在上述離心管中(zhong)配制反(fan)轉錄反(fan)應液

4 μl? 5×first-strand buffer

1 μl? dNTPs（10 mM each）

0.6μl ?RNasin ,

1 μl? ?M-MLV；

4按下列條件進行反轉錄反應

Oligo (dT)₁₅?：42℃溫浴(yu)60 min；

Random primer：?37℃溫(wen)浴(yu)60 min。

5終止反應

70℃溫浴5 min終止反應，置(zhi)冰上(shang)進行后續(xu)實驗或(huo)-20℃保存。

6用RNase-free ddH₂O將反應(ying)體系(xi)稀釋到50μl，取2-5μl進行PCR擴增(zeng)反應(ying)。