M-MLV?逆轉錄酶

產品說明

M-MLV逆(ni)轉(zhuan)錄(lu)酶(mei)(mei)是(shi)由一個?71 kD的單亞基組成的重組型(xing)DNA逆(ni)轉(zhuan)錄(lu)聚合酶(mei)(mei)。可以催化以RNA或DNA：RNA雜交鏈為模板的互(hu)補DNA?的聚合反應。本酶(mei)(mei)經修飾(shi)RNase H活性(xing)比普通(tong)的逆(ni)轉(zhuan)錄(lu)酶(mei)(mei)要弱很多，因此在合成第一鏈cDNA的過程中，可保證RNA的降(jiang)解程度較(jiao)低，從而使(shi)得率提高(gao)。

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產品組分

R1041可進(jin)(jin)行(xing)25次逆轉錄反(fan)應，R1042可進(jin)(jin)行(xing)50次逆轉錄反(fan)應（20 μl?標準?PCR?反(fan)應體系，每次使用?M-MLV 1 μl）。

M-MLV?儲存液成分

20 mM Tris-HCl (pH 7.5)，200 mM NaCl，0.1 mM EDTA，1 mM DTT，0.01% NP-40，50% glycerol

5x first-strand buffer?成分

250 mM Tris-HCl (pH 8.3 at 25℃)，375 mM KCl，15 mM MgCl₂，50 mM DTT

保存條件

-20℃保存，避免反(fan)復凍融。

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質量檢測

逆轉錄酶活性檢測

使用[₃₂P]dCTP作為標記，200 U的(de)M-MLV以1μg、1.2 kb的(de)RNA為模板(ban)進(jin)行逆(ni)轉錄反應(ying)，最低可(ke)得到120 ng的(de)cDNA，所得cDNA長度?>?全(quan)長的(de)90%。

核酸外切酶活性檢測

混合50 ng的標記DNA或RNA與200 U M-MLV在(zai)1×反(fan)應緩沖液體系中，37℃溫浴1 h，檢(jian)測DNA和RNA降解都不(bu)到總(zong)量的1%。

核酸內切酶活性檢測

混合1μgⅠ型超(chao)螺旋(xuan)質粒DNA與500 U M-MLV在1×反應緩沖液體系中，37℃溫浴1 h，瓊脂糖(tang)電泳(yong)檢測，無明(ming)顯的剪(jian)切(qie)。

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適用范圍

第一鏈cDNA?合成；cDNA?文(wen)庫(ku)構(gou)建；RT-PCR；引物(wu)延伸；3'?和?5' RACE。

注意事項

l??成功(gong)的(de)(de)cDNA合(he)成來自(zi)高質(zhi)量的(de)(de)RNA。高質(zhi)量的(de)(de)RNA至少應(ying)保證全長(chang)的(de)(de)完整性并且不含逆轉錄酶的(de)(de)抑制劑(ji)，如EDTA或?SDS。用(yong)于cDNA合(he)成反(fan)應(ying)的(de)(de)溶液(ye)試劑(ji)盡可能用(yong)DEPC進行處理，并在高壓滅菌(jun)(jun)后使用(yong)。有些試劑(ji)不能用(yong)高壓滅菌(jun)(jun)處理時，首先(xian)用(yong)經(jing)過滅菌(jun)(jun)的(de)(de)器具、水(shui)等配制溶液(ye)后，再將溶液(ye)進行過濾(lv)除菌(jun)(jun)處理。

l??為了增加貯(zhu)存RNA樣品的(de)穩定性，可(ke)以將RNA溶解在去離子的(de)甲酰(xian)胺中，存于(yu)-70℃。用于(yu)保存?RNA?的(de)甲酰(xian)胺一(yi)定不能含(han)有降解RNA的(de)雜物(wu)。來源于(yu)胰臟的(de)RNA至(zhi)少可(ke)以在甲酰(xian)胺中保存一(yi)年。當(dang)準備使(shi)用RNA時，可(ke)以使(shi)用下列方法沉(chen)淀RNA：加入NaCl至(zhi)0.2 M同(tong)時加入4倍(bei)體積的(de)乙醇，室溫放置3-5 min，10,000 rpm離心5 min。

l??在逆轉(zhuan)錄反應中經(jing)常加(jia)入RNase抑制(zhi)劑(ji)(ji)(ji)（RNasin）以增(zeng)加(jia)cDNA合成的長(chang)度和(he)產量。在第一鏈合成反應中，RNase抑制(zhi)劑(ji)(ji)(ji)在緩沖(chong)液(ye)和(he)還原劑(ji)(ji)(ji)（如?DTT）存在的條(tiao)件下加(jia)入，因為cDNA合成前(qian)的過程會(hui)使(shi)抑制(zhi)劑(ji)(ji)(ji)變性(xing)，從而釋(shi)放出RNase。但是RNase抑制(zhi)劑(ji)(ji)(ji)僅防止(zhi)RNase A，B，C?對RNA的降解，并不能防止(zhi)皮膚(fu)上的RNase，因此盡管(guan)使(shi)用了RNase抑制(zhi)劑(ji)(ji)(ji)，也(ye)要小心不要從手指上引入RNase。

l??較(jiao)高的保(bao)溫(wen)溫(wen)度有助(zhu)于RNA二級結構的打開，增加反應的產量。

l??使(shi)(shi)用簡單的(de)RNA純化方法(fa)即可獲得滿(man)足RT-PCR反應的(de)RNA，但為了保證(zheng)實驗的(de)成功率，建議使(shi)(shi)用GTC法(fa)（異硫氰酸胍法(fa)）制備的(de)高純度RNA。

l??為防止RNA降解，應盡量避(bi)免反(fan)復凍融(rong)，最好(hao)保存(cun)于-70℃。

l??最(zui)佳的(de)PCR反應條件(jian)，因PCR擴增儀的(de)不同而不同，所(suo)以(yi)在使用(yong)您的(de)樣(yang)品之前(qian)最(zui)好先試做(zuo)一下(xia)control反應，以(yi)確定最(zui)佳的(de)PCR反應條件(jian)。

l??cDNA產(chan)物應(ying)置于-20℃保存。

l??當以(yi)(yi)cDNA為(wei)模板進行PCR之前，使用RNase H處理cDNA，可以(yi)(yi)提高PCR反應(ying)的(de)靈敏(min)度。

操作步驟

1?在冰浴(yu)的無菌離心(xin)管中配制(zhi)下列混合物

2?進行變性退火反應

70℃溫浴(yu)5 min，簡(jian)短離心后冰浴(yu)5 min。

3?在(zai)上述離心管中(zhong)配制反轉錄(lu)反應液

4?按下列(lie)條件進行(xing)反轉錄反應

Oligo (dT)₁₅?：42℃溫浴60 min；

Random primer：?37℃溫浴(yu)60 min。

5?終止反應

70℃溫浴5 min終止反(fan)應，置(zhi)冰(bing)上進行后續實(shi)驗或-20℃保(bao)存。

6?用RNase-free ddH₂O將反應體(ti)系稀釋(shi)到50μl，取2-5μl進行PCR擴增反應。